痔血胶囊在2008年由于严重的肝毒性不良反应被国家食品药品监督管理局要求生产企业召回。在本课题组前期的研究中发现痔血胶囊的肝毒性药味是苦参,另一味药白鲜皮无明显的肝毒性。组方中的苦参(Radix Sophora flavescentis, Kushen)是豆科槐属植物苦参(Sophora flavescens Ait.)的干燥根,是中国传统的常用中药之一味苦性寒,具有清热燥湿、祛风解毒的功效。它始载于《神农本草经》,列为中品。苦参中的主要有效成分为生物碱类和黄酮类,以往人们仅对苦参中生物碱类成分作了大量深入的研究,评价苦参的质量也仅以生物碱的含量作为其质量优劣的标准,显然不够全面。同时,进一步的深入研究表明苦参中的黄酮类成分是苦参的一类活性成分,具有抗炎、抗菌、抗癌等多种药理作用和广阔的开发及应用前景,是一类非常有药用价值的活性成分,已成为当前中药苦参研究的热点。本课题组前期研究采用生物活性追踪方法结合原代大鼠肝细胞模型最终筛选出苦参中具有强烈肝毒性的异戊烯基黄酮类化合物——苦参酮(kurarinone, Kur),槐属二氢黄酮G(sophoraflavanone G, SFG)。为进一步研究肝毒性化合物的人肝细胞毒性参数及其代谢毒性机制,并为含苦参方药的安全性及制剂质量控制提供实验依据,本课题首先用半制备HPLC来制备得到单体化合物,在对单体化合物进行结构鉴定后进行人肝细胞毒性测定,然后用大鼠和人肝微粒体对含量较多的Kur进行体外代谢研究,以探讨代谢与毒性的关系,最后研究Kur在大鼠体内的毒代动力学。第一部分苦参肝毒性化合物的分离及体外毒性研究目的用半制备HPLC分离制备化合物单体并研究其体外细胞毒性参数。方法将苦参饮片粉碎后用95%乙醇回流提取3次,每次2h,收集乙醇提取液后经旋转蒸发仪蒸干有机相,然后加水分散后用乙酸乙酯萃取3次,收集有机相并挥干,将所得膏状物经半制备HPLC制备分离,分离条件同前期实验,收集与原Kur, SFG出峰时间相同的峰获得单体化合物后通过核磁及质谱进行结构鉴定。然后用所得单体在小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞株和人正常肝细胞系HL-7702细胞进行MTT试验测定细胞毒性参数。HPLC法测定苦参醇提物中Kur和SFG的含量。结果本次实验采用了比前期实验(70%乙醇)极性更低的溶剂95%乙醇回流提取及乙酸乙酯萃取这个方法后,富集了更多的肝毒性化合物的量。通过核磁及质谱进行结构鉴定,所收集的峰即为Kur和SFG。它们对3T3细胞的IC50(95%可信限)分别为37.17(35.81-38.58) μg/mL,33.91(31.28-36.76)μg/mL。对HL-7702的IC50(95%可信限)分别为21.13 (20.09-22.23) μg/mL,17.1(15.82-18.49)μg/mL。苦参醇提物中Kur和SFG的含量分别为17.13%和5.24%。结论低极性溶剂提取将增加含苦参方的肝毒性。Kur, SFG对人肝细胞和3T3细胞存在明显的毒性,苦参醇提物中Kur的含量约为SFG的3.3倍。第二部分苦参酮的体外代谢研究目的研究Kur经过大鼠和人肝微粒体孵育后所得代谢产物、代谢对毒性的影响及鉴定参与代谢的CYP450酶表型。方法将Kur与大鼠或人肝微粒体预孵育5 min后,加入NADPH、UDPGA或同时加入NADPH及UDPGA进行Ⅰ相、Ⅱ相及Ⅰ相加Ⅱ相反应后用高效液相色谱一电喷雾离子阱质谱法(LC-MSn)对代谢产物进行定性分析和半定量分析。采用大鼠肝微粒体,分为对照组和实验组。实验组加入不同浓度的Kur、微粒体和NADPH,对照组加入不同浓度的Kur、灭活的微粒体和NADPH,将整个体系加到铺有3T3细胞的96孔板中共培养24 h后加MTT测定细胞活力来判断代谢对毒性的影响。将Kur与人肝微粒体孵育后,通过化学抑制法用LC-MS测定母体化合物的剩余量来鉴定参与代谢的CYP450酶表型。结果大鼠肝微粒体主要Ⅰ相代谢产物是羟基化代谢物M1,准分子离子峰[M-H]-为m/z 453,还有少量的M2,准分子离子峰[M-H]为m/z 451,为双羟化后脱水的产物；Ⅱ相代谢产物是葡萄糖醛酸化产物M4-6,准分子离子峰[M-H]-为m/z 613,是三个同分异构体；Ⅰ相加Ⅱ相代谢产物是M1,M2。人肝微粒体Ⅰ相代谢产物是羟基化代谢物M1,M3,二者互为同分异构体,以M1为主；Ⅱ相代谢产物主要是葡萄糖醛酸化产物M4-6;Ⅰ相加Ⅱ相代谢产物是M1, M3, M4-6,以M6为主。Kur在6.25,25,50μg/mL时,与对照组相比,实验组细胞活力明显升高,差别有统计学意义。在体系中加入特异性CYP450酶抑制剂后,奥美拉唑、奎尼丁、4-甲基吡唑、酮康唑对Kur的代谢产生了显著的抑制作用(P<0.01),α-奈黄酮和磺胺苯吡唑也对代谢具有抑制作用(P<0.05)。结论Kur在大鼠和人肝微粒体有共同的Ⅰ相代谢产物M1和共同的Ⅱ相代谢产物M4-6,M2是大鼠特有的Ⅰ相代谢产物。Ⅰ相加Ⅱ相代谢产物大鼠肝微粒体以Ⅰ相代谢产物为主,人肝微粒体以Ⅱ相代谢产物M6为主。Kur在大鼠肝微粒体Ⅰ相代谢为代谢解毒,且参与的CYP450酶主要是2C19,2D6,2E1,3A4。第三部分苦参酮在大鼠体内的毒代动力学研究目的研究Kur在大鼠体内的毒代动力学,评价系统暴露与毒性剂量的关系。方法将SD大鼠随机分为溶剂对照组、苦参醇提物1.25 g/kg,2.5g/kg组,灌胃给药,每天2次,连续3天,于第1天第一次给药后0、0.5、1、2、3、4、6、8、12和24h通过眼球静脉丛采血。血样在4500 rpm离心10 min后收集血浆进行LC-MS测定Kur的含量。在0h,8h及末次灌胃给药3h后采血测定血清转氨酶,摘取心,肝,肾组织制备病理切片。结果在灌胃给药8h后,与对照组相比,苦参醇提物1.25 g/kg和2.5 g/kg组大鼠血清ALT, AST水平显著升高。在灌胃给药3天后,1.25 g/kg和2.5 g/kg组大鼠血清ALT、AST水平呈剂量依赖性升高。肝组织病理检查显示,苦参醇提物1.25 g/kg,2.5 g/kg大鼠肝细胞脂肪变性明显,肝细胞内出现大小不同的空泡。心脏与肾脏未见明显病理改变。苦参醇提物1.25 g/kg和2.5 g/kg大鼠血浆中Kur分别在1h和6h达峰,半衰期在5-6 h之间。结论苦参醇提物的对大鼠的毒性效应主要集中在肝脏,对心脏和肾脏无明显损伤。苦参醇提物对大鼠的肝损伤表现为转氨酶升高和肝组织脂肪变性。