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已有研究表明，胚胎干细胞和诱导多能干细胞在体外特定诱导条件下，能够向雌性生殖细胞发生分化。而且，通过与性腺体细胞共同组成“重组卵巢”后能进一步产生后代。由于受到材料来源和伦理学的限制，关于人雌性生殖细胞体外分化的报道较少。因此，我们利用特定的人羊水干细胞（humanAmniotic Fluid Stem Cells，hAFSCs）和胚胎多能干细胞（human Embryonic Stem Cells，hESCs）作为模式细胞，通过添加猪卵泡液（porcine Follicle Fluid，pFF）对人多能干细胞进行诱导，使其定向分化为雌性生殖细胞，具体研究内容和结果如下：1.人羊水干细胞的培养和鉴定将本实验室分离得到的hAFSCs细胞系070607株（46XX）、070609株（46XX）和091122株（46XY）进行复苏。经体外培养后，选取代次较低的hAFSCs，通过RT-PCR、流式细胞分选和免疫荧光组化等方法，检测三株细胞系多能性基因、细胞表面抗原和蛋白质的表达。结果发现070607细胞株的生长活力最佳，表达胚胎多能干细胞标记基因OCT4、NANOG和CD117，间充质干细胞标记基因CD90、CD44和CD29，不表达造血干细胞基因CD45；在蛋白质水平表达OCT4、SOX2、SSEA-4、TRA-1-60和CD117；同时，该株细胞含有间充质干细胞表面标志物CD29（99.2%）、CD117（99.8%）、CD44（99.8%），缺乏造血干细胞表面标记物CD34（0.1%）和CD45（0.1%）。2.人羊水干细胞向雌性生殖细胞的诱导分化采用两步法对070607株hAFSCs细胞进行诱导。首先将细胞培养在添加pFF的生殖细胞培养基中进行初步诱导，10~15天后，将形成的细胞集落转移到含有激素和生长因子的卵母细胞培养基中，对这些细胞集落进行二次诱导。诱导过程中，能发现处于不同阶段的雌性生殖细胞出现，如原始卵泡、次级卵泡、卵丘卵母细胞复合体和卵母细胞等。通过实时定量PCR检测显示，生殖细胞相关基因OCT4、IFITM3、DAZL、FIGLA、FSHR、CYP17和P450出现明显上调。诱导后期表达减数分裂基因DMC1和颗粒细胞特异性基因FOXL2。通过放射免疫法检测发现，诱导后的细胞能产生雌二醇；经流式细胞仪对DNA含量进行分析后发现，细胞发生了单倍体化。同时，在诱导不同时间，瞬时转染卵母细胞特异性报告载体pBMP15-EGFP，发现在诱导后10天后，体积较大的圆细胞呈GFP阳性，证明该细胞表达BMP15蛋白。采用免疫荧光组化的方法，检测到诱导后的生殖细胞表达特异性蛋白OCT4、NANOG、CD117和ZP2。而且，通过免疫印迹法也检测到ZP2蛋白的表达。除此之外，诱导后期能观察到形态类似于孤雌胚胎的细胞。上述结果显示，在本研究提供的诱导培养条件下，hAFSCs能够定向分化为雌性生殖细胞。3.人胚胎干细胞的培养、鉴定及其向雌性生殖细胞的诱导分化采用小鼠胎儿成纤维饲养层和无饲养层培养体系，对hESCs系H1（46XY）和H9（46XX）进行培养。检测发现，hESCs表达多能性相关的标记基因（OCT4和NANOG）和蛋白（OCT4、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4），在小鼠胎儿成纤维饲养层的培养条件下，能形成形态更加均一的类胚体。通过对hESCs的定向分化发现，单层细胞培养能够形成雌性生殖细胞。表达生殖细胞相关基因CD29、DAZL、STELLA、DMC1、BMP15和GDF9等。而通过类胚体诱导则向滋养层细胞发生了分化。