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细胞凋亡(apoptosis)又称程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD),是细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身程序,由基因控制的细胞自主性死亡方式,它与细胞增殖的动态平衡在维系生物体生长发育、内环境稳定和免疫调节中发挥着重要的作用。许多因素可诱导细胞凋亡,其中肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)主要通过死亡受体路径来诱导凋亡,分为TNF-α和TNF-β两种,前者来自单核巨噬细胞,后者由活化T细胞产生,而有关TNF-α对奶牛乳腺上皮细胞凋亡影响的研究,国内外尚未见报道。本实验采用三种不同的方法培养乳腺上皮细胞,组织块法、分离单细胞法培养出的原代细胞,经姬姆萨染色观察细胞形态学特点,结合上皮细胞特异性角蛋白-18单克隆抗体对体外培养获得的细胞进行免疫组化鉴定,证明培养的细胞为奶牛乳腺上皮细胞,而机械破碎法未获得奶牛乳腺上皮细胞。用纯化后的原代乳腺上皮细胞作为模型研究TNF-α对其致凋亡作用,实验应用0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL五种剂量的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作用体外培养的原代奶牛乳腺上皮细胞,分别于3h、6h、24h、48h和72h后,采用分光光度法检测Caspase-3酶活性,流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(Ps),二苯胺反应法(DPA)测DNA片段化,结果表明:TNF-α对奶牛乳腺上皮细胞凋亡有明显诱导作用,并呈浓度依赖型,凋亡的不同阶段与TNF-α作用的时间密切相关。TNF-ɑ能诱导caspase-3的激活,该过程可能是TNF-ɑ诱导乳腺上皮细胞凋亡的关键步骤之一,且Caspase-3活化是细胞即将发生凋亡之前的生化改变;TNF-ɑ诱导的早期凋亡细胞主要发生在24h,在48h、72h主要以晚期凋亡和坏死细胞为主,而总的凋亡和坏死比率在24h以后随时间的延长而增大,呈时间依赖性;二苯胺反应法检测发现DNA片段化百分率在6h时降低,24h以后逐渐升高,呈时间依赖性,与流式细胞仪检测的总的凋亡和坏死比率一致;Giemsa染色光镜形态学观察可见凋亡细胞形态。本实验为今后进一步探讨TNF-α和乳腺上皮细胞凋亡、病原感染的相互关系,以从细胞凋亡的角度阐明乳腺炎的发病机理,并为奶牛乳房炎的预防和治疗提供可靠的依据。