背景煤焦沥青(Coal tar pitch, CTP)是最早被发现的化学致癌物之一,它与职业性肿瘤的发生密切相关,但其诱导肿瘤的发病机制仍不清楚。本文主要通过研究煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞恶性转化过程中染色体变化,探讨染色体不稳定性(Chromosomal Instability, CIN)在癌变过程中的作用。染色体不稳定性是指细胞在有丝分裂过程中丧失和(或)获得整条染色体或染色体片段频率的升高。绝大多数肿瘤表现为染色体不稳定性,是恶性细胞最显著的特征之一染色体不稳定性主要表现为数目和结构改变。染色体数目的改变,又叫非整倍体,是指整条染色体的获得或丢失；染色体结构的改变包括染色体的缺失、扩增、倒位、易位、环状染色体、双着丝粒染色体等改变。染色体不稳定性的发生牵涉到细胞周期的各个环节。主要分为有丝分裂过程中姊妹染色单体分离异常、中心体异常、纺锤体检测点功能缺陷以及端粒异常等4大方面。1.姊妹染色单体分离及凝聚异常：DNA复制后,黏连素将2条染色单体包绕在环中保证姊妹染色单体配对。当Scc1亚基被分离酶(Separase)切开后,染色单体就会很容易被释放出来。在细胞周期的大部分时间内,分离酶与保全素(Securin)结合而其水解酶活性被抑制。在细胞周期中期到后期进行中,保全素被降解,释放分离酶,降解黏连素,使姊妹染色单体分离。2.纺锤体检测点功能减弱：如果Mad或Bub基因突变或表达降低,细胞会忽略纺锤体的损伤而继续分裂,从而形成异常核型。当检测到有未正确连接的动粒时,检测点相关蛋白Mad2被激活从而抑制后期促进复合物APC/C的活性,使保全素不能被水解,从而使姊妹单体不能分离。在肿瘤细胞中,纺锤体检测点功能较其正常组织明显减弱,并伴随高频率CIN。3.中心体异常：中心体异常与非整倍体和CIN呈正相关,并在实体肿瘤中普遍存在。中心体过表达在肺癌中很常见,并伴有明显不典型的形态、大小和数量异常。中心体的复制过程受到严格地调控。CDK2/CyclinE复合物在中心体复制的调控中起非常重要的作用。P53可以依赖P53/P21通路抑制CDK2/CyclinE的活性来调控中心体复制,P53失活或表达量降低和CvclinE频繁地过度表达,将会导致中心体扩增。P53与染色体不稳定/中心体扩增间存在正相关的关系。中心体异常导致染色体不稳定,对肿瘤的发生产生深远的影响。4.端粒、端粒酶异常：绝大部分肿瘤细胞的端粒缩短,端粒酶活性升高,以维持细胞的永生化。端粒缩短到一定程度将引起端粒末端的融合,引起“桥接-融合-断裂”循环导致染色体不稳定,最终演化为肿瘤细胞的核型,产生癌变。TRF1主要负责负性调节端粒的长度,控制端粒的延伸。TRF2主要负责保护染色体的末端。TRF2丢失将会导致染色体末端失去保护,造成端粒3’端丢失和染色体末端-末端融合。POT1的作用主要是保护端粒末端单链DNA并与调控端粒酶的活性有关。核型分析表明,几乎所有的肺癌都表现出复杂的核型,大约70%-80%的肺癌具有三倍体、四倍体核型,并伴有染色体易位、缺失和异染色质等多种结构的变异。染色体数目和结构的改变均可引起染色体基因成分的改变。肿瘤细胞普遍存在的染色体不稳定性在肿瘤的发生、发展、演化过程中起到何种作用,目前尚有争论。本研究利用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B的恶性转化模型,在确定细胞发生恶性转化的前提下,观察细胞整个转化过程中不同时期染色体改变与细胞转化之间的关系,并对其可能的机制从姊妹染色单体分离及凝聚异常、纺锤体检测点功能的减弱、中心体异常和端粒、端粒酶异常等4个方面加以分析,以探讨煤焦沥青的致肺癌机制,为预防煤焦沥青接触者罹患职业性肺部肿瘤提供理论依据。研究目的分析煤焦沥青主成分,建立人支气管上皮细胞BEAS-2B的恶性转化模型；观察不同时期细胞的染色体不稳定性与细胞恶性转化之间的关系；从姊妹染色单体分离及凝聚异常、纺锤体检测点功能的减弱、中心体异常和端粒、端粒酶异常等4个方面分析染色体不稳性的机制,探讨煤焦沥青的致肺癌机制,为预防煤焦沥青接触者罹患职业性肺部肿瘤提供理论依据。材料和方法1实验材料：中温煤焦沥青：从安阳钢铁公司焦化厂获得,碾碎成10μm-20μm的微细粉,温度控制在400℃左右,任其产生烟雾,用粉尘采样器收集烟尘,二氯甲烷提取,DMSO溶解后常温保存备用。细胞株：永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞株。裸鼠：BALB/C裸鼠24只,雌性,SPF级,5-6周龄,体重10-20g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。2方法2.1煤焦沥青烟提取物成分分析和对BEAS-2B细胞毒性实验取煤焦沥青DMSO溶液,用气相色谱/质谱联用仪进行分析鉴定。通过NIST质谱库自动检索获得各成分鉴定结果,按照峰面积归一法进行相对定量分析。用MTT法检测煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞的毒性实验,并计算LCso。2.2煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B恶性转化和染色体不稳定性观察以2.0 mg/L煤焦沥青烟提取物诱导并观察BEAS-2B细胞传代转化过程中的形态学改变；检测细胞的锚着独立性生长能力并用裸鼠成瘤实验加以验证,用传统核型分析方法观察细胞染色体的动态变化。细胞出现形态学改变时,用流式细胞术检测细胞增殖周期变化并用M-FISH法观察细胞的染色体细微结构改变。煤焦沥青对细胞DNA损伤作用的检测：用诱导剂量(2.0 mg/L),对细胞染毒24 h,单细胞凝胶电泳观察煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞造成的DNA损伤作用。2.3煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B (?)田胞染色体不稳定性机制分析对诱导后第10、20和30代细胞均用间接荧光免疫法检测中心体的改变,用荧光定量PCR法检测端粒长度改变,荧光定量TRAP法检测细胞的端粒酶活性。用实时定量RT-PCR检测各组相关基因的mRNA表达水平；采用细胞爬片免疫组化的方法半定量检测相关基因的蛋白表达改变。3.统计学分析采用SPSS 12.0对数据进行统计学分析,对符合正态分布的数据,以x±s表示。多组数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,以a=0.05为检验水准(双侧)。结果：1.煤焦沥青烟提取物成分分析和对BEAS-2B细胞的急性毒性实验1.1成分分析煤焦沥青烟提取物中总计鉴定出的38种化合物,主要为多环芳烃类,占已鉴定成分的87.91%,其余主要为单环芳烃类、杂环类和烯烃类化合物。1.2细胞毒性实验煤焦沥青烟提取物对于BEAS-2B细胞生长的抑制作用随着剂量的加大而逐渐增强,呈对称S型曲线,LC5o为8.64mg/L。2.煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B细胞的转化和染色体不稳定性作用以LC5o的20%左右的剂量作为诱导剂量(2.0 mg/L)诱导细胞恶性转化,经过30代传代培养,细胞发生恶性转化。2.1细胞形态学观察第10代时,细胞形态无明显改变；第20代,诱导组部分细胞形态异常,生长代谢旺盛；第30代,诱导组细胞排列杂乱无规则,大小差异显著,细胞生长失去接触抑制,出现复层生长现象,可见异形核及病理性核分裂相。2.2细胞周期改变染毒组细胞传代至30代,流式细胞仪测定其细胞周期显示G1期细胞比例明显减少, G2/M期细胞比例明显增加,表明细胞正处于增殖旺盛状态,其周期较对照组已呈不同程度的生长加速现象。2.3软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤实验第10代细胞煤焦沥青组有克隆形成,形成率极低(0.4‰)。而第20代诱导组细胞克隆形成率升高,为5.93‰,高于其他两组,并且可看到明显的克隆集落；第30代时,煤焦沥青组细胞即能在软琼脂上形成阳性克隆,细胞克隆形成率为21.50‰,远远高于正常对照组和DMSO组。形态学上,煤焦沥青组形成的克隆生长紊乱,无接触抑制,可见重叠生长。煤焦沥青诱导30代细胞组接种裸鼠38d后,移植瘤的体积和重量均明显大于其它3组,差异有统计学意义(P<0.05)。瘤体HE染色结果显示,煤焦沥青诱导的第30代细胞在裸鼠体形成的肿瘤,组织结构紊乱,核异形明显并可以发现小血管形成。说明30代细胞已经恶性转化。2.4染色体不稳定性的观察煤焦沥青诱导组第10代细胞二倍体核型的比例明显下降,非整倍体细胞的比例明显增加,尤其是亚二倍体和超二倍体的比例升高较多,采用列联表χ2检验分析,3组间细胞染色体数目差异有统计学意义(P<0.05)。χ2分割后分析,煤焦沥青组与正常对照组和DMSO组间染色体数目差异有统计学意义(P<0.05),但正常对照组与DMSO组间比较差异无统计学意义(P>0.05)煤焦沥青组第20代细胞二倍体核型比例进一步减少(17%),亚二倍体(19%)、超二倍体(62%)所占的比例进一步增高。煤焦沥青诱导组第30代细胞染色体二倍体核型比例更少(7%),出现了大量非整倍体细胞,其中包括亚二倍体(15%)和超二倍体(78%)M-FISH结果表明BEAS-2B细胞本身已经处于不稳定的核型,其染色体数目虽然以近二倍体为主,但是其染色体结构中有大量的交叉互换。煤焦沥青诱导组BEAS-2B细胞核型极不稳定,出现大量的多倍体核型和亚2倍体核型,染色体有大量的移位,交叉互换和缺失,每个细胞核型的细微结构都有差异。2.5煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞的DNA损伤作用用诱导剂量(2.0mg/l),对细胞染毒24h,单细胞凝胶电泳结果显示,煤焦沥青组尾长,尾距,彗星长和Olive尾矩均显著增加,与空白对照组和DMSO组相比较有统计学意义(P<0.05)。说明煤焦沥青可以直接作用于BEAS-2B细胞引起DNA损伤,产生遗传毒性。3煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B细胞染色体不稳定性机制研究3.1煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞姊妹染色单体分离及凝聚相关基因的影响诱导组第30代细胞中,SMC1基因mRNA表达水平3组间比较差异没有统计学意义(P>0.05)；SMC3和分离酶的基因mRNA表达水平明显升高,保全素的基因mRNA表达水平明显降低,与其它两组相比差异有统计学意义(P<0.05),而其它两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示,诱导组第30代细胞中,SMC1的表达水平没有改变(P>0.05),而SMC3和分离酶的蛋白表达水平升高,保全素蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),而其它两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.2煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞纺锤体检测点相关蛋白的影响与正常对照组和DMSO组相比较,诱导组第30代细胞Mad2、Bubl、APC基因mRNA的表达均降低(P<0.05)。诱导组第30代细胞Mad2、Bub1和APC基因的蛋白表达都有所降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。正常对照组和DMSO组之间3种基因的mRNA和蛋白表达水平均没有明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。3.3煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞中心体的影响3.3.1中心体的改变煤焦沥青诱导后第10代细胞中心体存在数目和形态异常,总异常率为2.79%,高于其它两组。但3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。第20代细胞中心体总异常率为6.56%,主要表现为中心体数目异常(3.41%),明显高于正常对照组和DMSO组,而其它两组间的比较差异无统计学意义(P>0.05)。第30代细胞中心体总异常比例明显增大(22.39%),表现有3种类型,包括数目异常(12.70%)、形态异常(5.69%)、数目及形状异常(4.00%),与其余两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.3.2 P53,P21和CyclinE mRNA水平的改变诱导组第10代细胞中P53、P21和CyclinE mRNA的变化与其它两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；而诱导组第20代和第30代细胞中P53、P21mRNA表达量均低于其它两组,而CyclinE mRNA表达量高于其它两组。差异具有统计学意义(P<0.05)。3.3.3 P53、P21和CyclinE蛋白水平的改变诱导组第10代细胞中P53、P21和CyclinE蛋白表达水平与其它两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；而诱导组第20代和第30代细胞中P53、P21蛋白表达水平均降低,CyclinE蛋白表达水平降低高于其它两组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.4煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞端粒、端粒酶的影响3.4.1端粒长度和端粒酶活性的改变与正常对照组和DMSO组相比较,中温煤焦沥青组第20代和第30代细胞端粒DNA相对长度变短、端粒酶相对活力增高差异均有统计学意义(P<0.01)。而第10代正常对照组,DMSO组和中温煤焦沥青组相比较,各组之间各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。3.4.2 POT1、TRF1和TRF2基因mRNA表达水平变化与正常对照组和DMSO组相比较,中温煤焦沥青组第20代和第30代细胞POT1和TRF1基因mRNA表达水平下调、TRF2基因mRNA表达水平上调,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。而第10代3组之间各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。3.4.3 POT1、TRF1和TRF2基因蛋白表达水平变化：与正常对照组和DMSO组相比较,中温煤焦沥青组第20代和第30代细胞POT1和TRF1蛋白表达水平降低、TRF2蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。而第10代3组之间各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：煤焦沥青烟提取物成分复杂,主要含多环芳烃。其对细胞具有遗传毒性,在体外可以诱导BEAS-2B细胞产生染色体不稳定性并发生恶性转化。在建立的诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化模型中观察到染色体异常发生在细胞恶性转化的早期,先于细胞形态和功能改变。在煤焦沥青致支气管上皮细胞恶性演化过程中,多种机制参与了染色体不稳定性的形成,最终演化成恶性转化细胞。