【摘 要】
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新型鸭呼肠孤病毒病是由新型呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）感染引起的传染病,该病临床表现以肝脏呈不规则块状或斑状坏死及脾脏坏死为主要特征,俗称“鸭新肝病”、“鸭坏死性肝炎病”等。新型鸭呼肠孤病毒病是近些年来在我国养鸭场普遍存在的疾病,严重危害养鸭业的发展,目前在实际生产中缺乏有效的疫苗进行防控。乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB）是人和动物肠道内
【基金项目】
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山东省重点研发计划（2022CXGC010606）; 山东省家禽产业技术创新体系（SDAIT-11-15）
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新型鸭呼肠孤病毒病是由新型呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）感染引起的传染病,该病临床表现以肝脏呈不规则块状或斑状坏死及脾脏坏死为主要特征,俗称“鸭新肝病”、“鸭坏死性肝炎病”等。新型鸭呼肠孤病毒病是近些年来在我国养鸭场普遍存在的疾病,严重危害养鸭业的发展,目前在实际生产中缺乏有效的疫苗进行防控。乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB）是人和动物肠道内的常见菌,被GRAS（Generally Recognized as Safe）公认为安全级微生物,被广泛应用在了食品、药品、保健品及饲料添加等领域。近几年,人们对于乳酸菌的研究逐渐变深变广,在基因工程和遗传等方面也开始涉及。乳酸菌还可以用来制备安全无毒、给药快捷便利、具有良好保护效果的口服微生态制剂,乳酸菌微生态制剂通过胃肠道粘膜对抗原进行传递,从而诱导动物机体产生高效的免疫应答。本研究拟将NDRV主要抗原蛋白σC基因导入乳酸菌表达系统,将σC蛋白展示在乳酸菌表面,制备乳酸菌活载体疫苗,刺激机体黏膜免疫系统产生特异性抗体,保护机体抵抗NDRV的侵害。研究内容主要包括以下两个部分。第一部分:表达NDRVσC蛋白重组乳酸乳球菌菌株的构建。本试验选择乳酸乳球菌MG1363作为活菌载体,选择大肠杆菌-乳酸菌组成型穿梭质粒p MG36e作为表达载体,用于表达NDRVσC蛋白的乳酸菌活载体疫苗的构建。首先通过设计引物将基因T7g10L-Usp45与pgs A融合,获得T7g10L-Usp45-pgs A基因片段,然后利用同源重组技术构建质粒T7g10L-Usp45-pgs A-σC-e GFP基因片段,将该基因插入载体p MG36e的多克隆位点区中,以HindⅢ和XbaⅠ作为插入位点,构建大小为6054bp的重组质粒。并将重组质粒通过电转化技术转入乳酸乳球菌MG1363中,成功构建重组乳酸乳球菌T7g10L-Usp45-pgs A-σC-e GFP-p MG36e/MG1363。对重组后的乳酸乳球菌进行荧光显微镜镜检,σC重组乳酸乳球菌在蓝色激发光作用下发出绿色荧光,通过Western Blot对σC蛋白重组乳酸乳球菌细胞表面的表达情况进行鉴定,结果显示成功表达约80k Da的σC融合蛋白。上述试验结果表明NDRVσC融合蛋白成功在乳酸菌表达并通过跨膜锚定域将蛋白锚定在细胞壁上。第二部分:表达NDRVσC蛋白的重组MG1363/σC乳酸乳球菌免疫效果评价将培养后的重组MG1363/σC乳酸乳球菌、空载体MG1363/p MG36e乳酸乳球菌和乳酸乳球菌MG1363口服免疫2日龄雏鸭,连续免疫七天,并以空白组作为阴性对照。用ELISA方法检测血清和小肠液中特异性抗体Ig G、非特异性抗体s Ig A和细胞因子水平,对免疫效果进行评价。结果显示,σC重组乳酸乳球菌试验组血清中检测到的NDRV特异性Ig G抗体和肠黏膜中s Ig A的总量显著增加;IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10各细胞因子水平与其他对照组比较均差异性显著（P＜0.05）。每组平均分配两只肌肉注射NDRV毒株的8日龄雏鸭,用来模拟自然感染,监测每组雏鸭的死亡率。实验结果显示σC重组乳酸菌组雏鸭的保护率达76.67%。本研究构建的乳酸乳球菌可作为一种黏膜免疫微生态制剂为NDRV的防控提供一种新的途径。
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