论文一单纯性先天性白内障的分子遗传学研究先天性白内障是指在孕期或胎儿期由于各种因素使晶状体发育受到影响,导致出生时或出生一年以内出现不同程度的晶状体浑浊,是儿童致盲的首要原因之一。大约1/3的先天性白内障与遗传有关,临床表现可为单纯眼部异常,也可作为某些综合征的表型之一,具有明显的临床异质性和遗传异质性。常见的遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和性染色体连锁遗传,其中以常染色体显性遗传最为多见。第一部分三个先天性白内障家系的致病突变研究本研究小组的前期工作通过微卫星标记的两点连锁分析,将一个中国汉族单纯性先天性后极性白内障家系的致病区域锁定在染色体1p36,这与1997年报道的英国先天性后极性白内障家系和2005年报道的澳大利亚先天性全白内障家系的定位区域一致,后两个研究小组自定位后尚未确定致病基因。结合澳大利亚家系的连锁范围,我国家系最终精细定位于微卫星标记D1S436与D1S199之间大约4Mb的范围内。本文第一部分以上述中国（家系1）、英国（家系2）和澳大利亚（家系3）家系作为研究对象。首先在家系1对定位区域内6个候选基因进行突变筛查。结果在EPHA2基因第16外显子内检测到一个错义突变,c.2819C>T,使编码蛋白第940位苏氨酸变为异亮氨酸（p.T940I）。对家系1所有成员以及202个无关健康个体进行酶切验证,结果表明所有患者均携带该突变,突变与疾病表型共分离。随后对家系2和家系3中患者EPHA2基因进行突变筛查。结果在家系2第17外显子发现一个缺失突变,c.2915₂916de1TG,使编码蛋白自第972位发生氨基酸改变,产生39个新的氨基酸。在家系3第16内含子检测到单个核苷酸改变,c.2826-9G>A。使用Minigene检测法证实该突变可使剪接位点发生改变,导致7个核苷酸的插入,使编码蛋白自第943位发生氨基酸改变,产生71个新的氨基酸。这是国际首次将EPHA2确定为先天性白内障的致病基因,也是首次将Eph家族与单基因遗传病联系起来。为方便描述,将携带p.T940I.c.2915₂916delTG和c.2826-9G>A的突变型蛋白分别简称为T940I、C39和C71。EPHA2是Eph受体家族的一员,广泛表达于上皮来源的细胞。在ephrinA配体的激活作用下,参与细胞迁移和凋亡等过程,在胚胎发育和肿瘤发生中起到重要的调控作用。为了进一步研究EPHA2基因突变导致先天性白内障的分子机制,我们首先通过RT-PCR在人类晶状体组织和培养的人类晶状体上皮细胞对EPHA2的转录本进行鉴定,并结合BALB/C小鼠晶状体免疫组化染色,明确了EPHA2在晶状体上皮细胞中的表达。随后我们对外源表达野生型与突变型EPHA2后,晶状体上皮细胞的迁移和凋亡进行检测。发现三种突变型蛋白与野生型相比对晶状体上皮细胞的迁移和凋亡均没有显著影响,推测上述突变可能导致编码蛋白功能的缺失,以致于无法通过外源转染的方法检测到突变型蛋白的获得功能效应。此外我们发现,外源转染后三种突变体的蛋白水平均明显低于野生型,并且在使用MG132抑制蛋白酶体降解途径后,突变型的蛋白水平明显回升。提示突变型蛋白易于发生降解这样一种“缺失功能效应”可能是三种突变导致先天型白内障的共同机制之一。已有研究表明,ephrinA配体结合后,EPHA2受体寡聚并发生自我交互磷酸化,受体的寡聚是其磷酸化的必要条件,而磷酸化的受体容易被内吞并通过蛋白酶体途径降解。SHIP2和LMW-PTP可以结合至磷酸化受体C末端的结构域参与维持其稳定。我们通过酵母双杂交实验发现,T940I对SHIP2的结合力减弱,而C39和C71与自身的相互作用增强,提示三种突变型蛋白可能通过不同的机制发生降解。此外,酵母双杂交实验中,C39和C71对野生型EPHA2以及LMW-PTP的结合力明显增强,提示突变型蛋白存在“显性负效应”和“获得功能效应”也是先天性白内障的发生机制之一。第二部分一个先天性全白内障四胞胎家系致病基因的定位研究本文第二部分以一个中国汉族先天性全白内障家系作为研究对象。家系两代7人,第二代5人（Ⅱ1-Ⅱ5）中个体Ⅱ-Ⅱ5为异卵四胞胎,其中Ⅱ2、Ⅱ4和Ⅱ5为患者。在排除了宫内感染风疹病毒导致先天性白内障的可能性后,我们通过微卫星标记的两点连锁分析,在排除了40个已知基因座和9个自选基因座的致病性后,发现了一个新的可能致病区域,染色体6q15-qter。在该区域内选择GJA1、GJA10、HSF2、COL10A1、SLC35F1、SLC22A16、SLC2A12、SAMD3、PRDM1、EPHA7、FYN、 FOXO3、SNX和WASFl作为候选基因进行直接测序,并最终排除了这14个基因。