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在全球范围内,肺癌发病率和死亡率居高不下,并在两性中分别即将取代前列腺癌和乳腺癌的地位,成为威胁人类健康的第一杀手。非小细胞肺癌(Non-Small-Cell1LungCancer,NSCLC)占肺癌的大多数。尽管近年来在肺癌的临床治疗方面有突破,包括开发更敏感的早期诊断方法、改良更为科学的手术方式和研究肺癌发生发展重要信号通路的新型靶向治疗,但5年生存率仍然很低。Wlims’tumor gene 1(WT1)位于人类11号染色体,是一类能编码49-52kD肽链的细胞内转录因子,最早在肾母细胞瘤(Wlims’瘤)中作为肿瘤抑癌基因被发现。但在随后的包括对白血病和实体瘤的研究中,提示WT1具有癌基因的特点,发挥促进肿瘤的发生发展的作用。目前,在肺癌中,虽然主流观点认为WT1发挥促癌的作用居多,并且在日本已经有针对WT1这一位点的免疫治疗案例出现,但是在全球范围内,学术界认为将WT1定性为促肺癌因子尚缺乏确凿证据。WT1这条变色龙基因(Chameleom Gene)在NSCLC中究竟扮演什么角色,为什么会出现类似组织特异性的调控特点,以及能否成为临床上有价值的分子标志物指导NSCLC的诊断和治疗,这些是当前国内外研究WT1的科学家们亟需攻克的主要堡垒。目标:探讨WT1基因在NSCLC生物学行为多个环节中的作用及其分子机制。方法:第一部分:慢病毒载体构建稳定过表达WT1D和沉默WT1D的A549、H1568和H1650肺癌细胞系,在A549细胞系中使用全基因组芯片筛选出可能受WT1D调控的靶点和信号通路。第二部分:1.siRNA和脂质体法在H1299(KRAS突变型)和H1568(KRAS野生型)细胞中均构建WT1过表达和沉默体外模型,并用MTT法和Ki-67染色检测WT1被过表达和沉默后NSCLC细胞增殖情况;TUNEL法和凋亡通路蛋白芯片检测WT1沉默后NSCLC细胞凋亡情况。2.选用生物信息学和双荧光素酶报告基因法Dual Luciferase reporter assay检测WT1与候选基因cMyc启动子区域靶向结合和调控作用。3.构建裸鼠皮下肿瘤种植模型,观察A549(KRAS突变型)、H1568和H1650(KRAS野生型)细胞在体内生长情况。4.焦磷酸测序(Sanger Sequencing)检测 NSCLC组织标本 KRAS突变情况,结合临床资料和随访进行统计学分析。5.实时定量逆转录多聚酶链式反应(realtime RT-PCR)检测NSCLC和对应癌旁组织中WT1和cMyc的表达情况;结合临床资料进行统计学分析。第三部分:1.选取KRAS野生型的H1568和H1650细胞,采用划痕实验和Tranwell实验验证WT1D过表达和沉默后NSCLC细胞迁移和侵袭情况。2.PCR芯片检测转移信号通路主要基因的改变3.选用生物信息学和Dual Luciferase reporter assay检测WT1D与候选基因CDH1启动子区域靶向结合和调控作用。结果:第一部分:在A549细胞中,WT1D参与调控多个基因,影响细胞组成和功能,并且与细胞凋亡等信号通路有关。第二部分:1.在KRAS突变型的H1299细胞内,WT1A和WT1D通过直接调控cMyc的转录,进而参与调节细胞的增殖和凋亡;在KRAS野生型的H1568细胞中未发现此现象。2.裸鼠体内,过表达WT1D的A549细胞成瘤体积明显大于对照组和WT1沉默组;但H1568和H1650细胞无明显改变。3.77例NSCLC患者中,19例存在KRAS突变,KRAS突变与患者临床分期明显相关,并且提示预后不良;WT1和cMyc在肿瘤中的表达明显高于癌旁,并且在mRNA水平存在相关性。生存分析结果显示WT1和cMyc高表达在存在KRAS突变的NSCLC患者中提示预后不良。第三部分:1.H1568细胞内,WT1D通过结合到CDH1启动子区域,负向调节其转录水平,从而正向调控肺癌细胞的迁移和侵袭能力。2.在159例NSCLC中,肿瘤中WT1表达高于癌旁,CDH1低于癌旁;两者呈负相关,并均与临床分期、转移情况和生存率有关。结论:本研究中,我们发现在KRAS突变情况下,WT1正向调控NSCLC细胞的增殖,这可能是由于其在转录水平调控cMyc,影响细胞增殖和凋亡信号通路造成的;WT1高表达有可能作为提示预后不良的独立因素;WT1D本身作为转录因子,也在转录水平调控转移相关蛋白CDH1,从而可能参与调节NSCLC的侵袭和转移。同时,WT1也有可能成为监测NSCLC发展、转移和预后的生物标志物;KRAS突变和WT1有可能为NSCLC分子分型提供一定的思路。