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长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是一种吸血性外寄生虫,主要寄生于哺乳动物鸟类体表,广泛分布于东亚、新西兰、澳大利亚及我国多个省市,是巴贝斯虫和泰勒虫等多种病原的主要传播媒介,严重威胁人类和动物健康。microRNA是一类由18~25个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA,研究表明,miRNA在吸血性节肢动物体内发挥重要作用,尤其是参与吸血和繁殖,因此,深入了解miRNA与长角血蜱发育繁殖相关的潜在分子机制,为有效免疫防控提供一种新的方法和理论性依据。本实验通过qPCR的方法分析了miR-275在长角血蜱不同组织及发育阶段的表达水平,结果表明miR-275在长角血蜱各个组织及发育阶段均有表达,且差异性显著,表明其表达具有组织和阶段特异性。在饥饿状态下,miR-275在中肠表达量最高,分别是唾液腺和卵巢的1.91倍和1.28倍;与饥饿状态相比,饱血状态下miR-275在卵巢和中肠的表达量显著升高,分别升高了2.72倍和1.67倍,而在唾液腺中表达量降低了0.806倍,推测其可能与蜱虫的卵巢发育及血液消化有关。分析长角血蜱不同发育阶段miR-275的表达水平,结果表明,饱血雌性成蜱和卵的表达量显著高于其他阶段,推测miR-275在饱血成蜱及卵中发挥重要功能。利用RNAhybrid软件对miR-275靶基因进行预测,预测结果发现miR-275在卵黄原蛋白基因(Vg-2)开放阅读框中有2个经典的结合位点。双荧光素酶报告系统结果显示,实验组荧光信号活性为66.08%,与对照组相比差异显著,实验结果在体外证明miR-275的靶基因为Vg-2。将mi R-275抑制剂antagomir(Ant-275)和阴性对照missense(MsAnt)分别注射到饥饿雌性长角血蜱体内,qPCR结果显示,注射antagomir之后可显著抑制内源性miR-275(p<0.05);分析各组蜱虫的生理指标显示,与对照组相比,实验组蜱虫的卵巢发育明显受到抑制,发育成熟的卵泡量显著减少;饱血雌蜱产卵量显著降低、体重下降缓慢、产卵时间延长且完全干瘪重量与对照组相比较重(p<0.01)。在抑制miR-275之后,长角血蜱的卵巢发育和血液消化均出现异常,表明miR-275在长角血蜱卵巢发育和血液消化过程中发挥重要作用。为在体内进一步验证Vg-2是否为miR-275的靶基因,对长角血蜱进行基因回补实验。将mi R-275抑制剂antagomir和Vg基因抑制剂dsRNA(dsVg)共同注射到饥饿长角血蜱体内,结果显示,注射Ant-275/dsVg饱血体重高于单独注射dsVg但仍低于Ant-275/dsLuc阴性对照,产卵量显著高于单独注射Ant-275和dsVg组,低于non-injection空白对照。表型的部分恢复在体内证明了miR-275的靶基因为Vg-2。对长角血蜱Vg-2进行RNAi后,长角血蜱饱血后重量为98.77mg,产卵率为25.9%,与对照组相比差异均极显著,表明Vg-2基因在长角血蜱的吸血和产卵过程中发挥重要作用。