卵白蛋白（OVA）占蛋清蛋白质总量的54%～65%,是蛋清中唯一含有埋藏于疏水核心内部的自由巯基的蛋白质。本课题通过磷酸化修饰卵白蛋白,改善其乳化活性、乳化稳定性和泡沫稳定性等界面特性、以及质构特性和流变特性。采用SEM、XRD、DSC研究磷酸化卵白蛋白微观形貌、结晶结构和热性能的变化,通过FTIR、FT-Raman、CD和荧光光谱等探索磷酸化卵白蛋白分子构象和分子间相互作用,并结合13C NMR、31P NMR、XPS和MALDI-TOF/MS探讨磷酸化对卵白蛋白的分子组成和结构的影响。从原子及分子水平上阐明磷酸化改善卵白蛋白的微观结构和功能性质的分子机制,旨在为卵白蛋白在食品工业中的应用提供理论基础和实验支撑。主要研究内容与结果如下:1.基于离子交换法和脱离色谱柱,实现两步纯化卵白蛋白,显著缩短了纯化的时间,提高蛋清液处理量和卵白蛋白产量。优化条件为:Q-Sepharose FF凝胶与样液的吸附达到饱和时的体积比为1:3、Q-Sepharose FF凝胶完成对蛋清液中蛋白的吸附所用最短时间为20min。用含0.08mol/LNa Cl的Tris-HCl缓冲液洗脱杂蛋白10min,再用含0.15mol/LNa Cl的Tris-HCl缓冲液洗脱10min,得到的卵白蛋白产物纯度达到97.84%,回收率为79.4%。Western Blot和ELISA实验表明纯化后卵白蛋白的免疫活性较好,该纯化方法温和且较好的保留了卵白蛋白的结构完整性。2.研究磷酸化卵白蛋白（P-OVA）的分子特性。探明p H对天然卵白蛋白（N-OVA）磷酸化程度的影响,当反应p H为7.0时OVA磷酸化程度最大。DSC和TG结果表明磷酸化后卵白蛋白的热稳定性提高。磷酸基团的修饰使OVA的等电点（p I）向低p H方向偏移,且随着磷酸化程度的增加蛋白分子的等电点从4.723（N-OVA）迁移到4.398（P-OVA7）。SDS-PAGE的结果表明P-OVA的电泳迁移率增加。P-OVA5分子的内部疏水基团暴露,表面疏水性显著提升;而P-OVA7和P-OVA5与N-OVA相比表面疏水性减小。P-OVA7和P-OVA9的分子平均粒径D[4,3]减小,SEM进一步证明了磷酸化后卵白蛋白分子粒径减小,较好地维持了卵白蛋白的空间三维结构。3.系统分析磷酸化卵白蛋白的构效关系。FTIR和Raman光谱表明磷酸基团成功接枝到OVA分子上并形成P-O键,且Raman光谱表明由于带负电荷的磷酸基团的接入,卵白蛋白的酪氨酸残基及碳链骨架微环境的极性增加。进一步对红外光谱的酰胺Ⅰ带进行高斯拟合和二阶导,发现固态N-OVA与P-OVA二级结构以β-折叠为主,无规则卷曲含量低;而圆二色谱表明溶液中N-OVA与P-OVA二级结构以无规则卷曲为主。P-OVA7和P-OVA9由于磷酸基团的屏蔽效应,λ280nm处的紫外吸收下降。此外,紫外二阶导光谱表明P-OVA7与P-OVA9的酪氨酸和色氨酸残基吸收峰蓝移,氨基酸残基微环境更亲水。XRD分析表明磷酸化后OVA特征衍射峰数目降低,峰强度增加,表明磷酸化后卵白蛋白分子发生了结构重排和定向排列,产生了更大的晶粒。4.研究了磷酸化卵白蛋白界面特性。P-OVA乳液的zeta电位绝对值增加,乳液平均粒径D[4,3]减小。通过60 min的存放考察乳液的稳定性,N-OVA乳液平均粒径显著增加,对应的粒径分布表明乳液失稳出现水油分离现象;而P-OVA5乳液平均粒径没有明显增加,粒径呈现均一的单峰分布,具有更好的乳化稳定性,对应更高的ESI值。P-OVA具有比N-OVA更大的EAI值,表明磷酸化后卵白蛋白的乳化活性提高。此外,乳液的微观形貌观察表明,P-OVA的乳液粒径减小,呈现更致密和均匀的分布状态。另一方面,P-OVA9在油/水界面具有较低的界面张力。不同p H磷酸化反应的卵白蛋白分子在空气/水界面表现出明显差异的界面行为,磷酸化后卵白蛋白的起泡性和泡沫稳定性均增加。5.N-OVA和P-OVA热诱导凝胶的质构特性和流变性随着蛋白浓度的增加而改善。通过质构和动态流变分析表明,磷酸化程度最大（P-OVA7）的热诱导凝胶具有最大的硬度、粘性、粘弹性模量和黏度,且P-OVA7凝胶结构稳定,频率依赖性小。P-OVA5的凝胶点提前,表明磷酸化促使蛋白凝胶网络在更低的温度下形成。蠕变-恢复实验表明,磷酸化热凝胶柔量相比N-OVA明显降低,提高了凝胶结构的刚性,从而对机械形变的抵抗性增加,最大机械形变（JMax）减小,不可逆形变（J∞）减小,凝胶的恢复性提高。此外,SEM显示,N-OVA热凝胶孔隙较大,结构容易崩塌发生不可逆的形变;而P-OVA7和P-OVA9的热凝胶以致密的凝胶网络形式存在,因此具有更好的机械性能。LF-NMR结果表明,P-OVA7热凝胶的T2弛豫时间相比N-OVA减小,磷酸化后通过形成更致密的凝胶结构,增强了对水分子的束缚力,从而提高了凝胶的持水性。凝胶的质子密度加权图像进一步说明了磷酸化后热凝胶的持水性增加。6.探索了磷酸化对卵白蛋白与IgG特异性结合的影响。氨基酸组成分析表明,磷酸化后OVA对应的氨基酸组成含量发生变化,导致OVA的抗原表位改变。优化间接ELISA的条件,得到一抗和二抗适宜的工作浓度分别为1:17500和1:250,确定抗原包被浓度0.4μg/m L。间接ELISA的结果表明,与N-OVA相比,P-OVA7和P-OVA9的抗原性减小,而P-OVA5吸光值增加。Western Blot显示P-OVA条带变窄变浅,对应的抗原性略微下降。另一方面,通过氧化石墨烯修饰玻碳电极,利用EDC/NHS活化电极表面羧基并共价偶联结合兔抗OVA IgG,制备的OVA生物传感器与间接ELISA方法相互补充,通过循环伏安法,差分脉冲伏安法和交流阻抗法检测表明,磷酸化卵白蛋白与IgG的结合能力减弱,抗原性降低。7.通过13C NMR、31P NMR、XPS和MALDI-TOF/MS分析,结合磷酸化卵白蛋白的分子特性和结构的变化,以及磷酸化对卵白蛋白界面特性、热诱导凝胶性能及抗原性的影响,可以得出磷酸化卵白蛋白的磷酸化位点及磷酸化对卵白蛋白的分子特性和功能性质的影响机制:通过一步法接枝磷酸根基团到OVA分子中,磷酸化反应的位点主要发生在卵白蛋白分子的丝氨酸残基的βCH2基团的C原子位置上,形成新的O-P键。由于负电性的磷酸根基团引入到OVA分子中,OVA分子的等电点向低p H值偏移,表面张力减小,分子间斥力增大,从而使磷酸化OVA的乳化活性提高,泡沫稳定性增加,改善了界面性能和凝胶性能。