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灵芝(Ganoderma lucidum)作为珍贵的药用真菌在我国已有悠久的历史,2000多年前人们就已经发现它的药用价值。灵芝的主要活性成分之一是多糖类物质,因其具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性而备受关注。液体深层发酵技术生产灵芝多糖能够缩短生产周期,降低生产成本,而且不受季节影响,从而显著提高生产效率,成为当前研究的热点。本研究首先对收集到的灵芝菌株以高产胞内多糖为目标进行筛选,其次,对筛选到的菌株在发酵罐上进行通气量因素研究,再次,对筛选获得的灵芝菌株的发酵工艺参数进行优化,在此基础上以期获得最佳的发酵条件为规模化生产提供技术支持,最后对获得的灵芝胞内胞外多糖粗提物进行免疫活性实验。本论文共分为四部分,分别研究菌株的筛选及其动力学过程、提出多阶段通气量控制策略、优化灵芝菌丝体胞内多糖液体深层发酵工艺、测试胞内胞外多糖免疫活性,主要结果如下:1、灵芝液体深层发酵高产胞内多糖菌株的筛选及其动力学研究通过对实验室保藏的72株灵芝菌株液体深层发酵合成胞内多糖进行筛选研究,分析菌株液体深层发酵的菌丝体生物量和胞内多糖含量两个指标,并以胞内多糖得率为筛选依据,得出72株菌株中得率最高的三株菌株为G0041,G0069和G0119。考虑到G0119在栽培上的良好效果,对G0119菌株进行了详细的发酵过程研究,最大菌丝体生物量达到22.48 g/L,最大胞内多糖含量达到18.25 g/100g菌丝体,最大胞内多糖得率达到1.48 g/L。其次,对G0119进行动力学模型的构建,得到菌丝体生长、产物胞内多糖生成和底物还原糖消耗的动力学方程。该方程的建立为后续灵芝液体深层发酵胞内多糖的优化及其规模化生产提供理论研究基础。2、多阶段通气量控制策略发酵生产G0119胞内多糖采用6 L搅拌式发酵罐进行扩大培养实验,研究G0119菌丝体发酵合成胞内多糖的情况,考察不同通气量对G0119菌丝体生长、比生长速率、G0119胞内多糖合成、比合成速率以及p H、溶氧变化的影响。结果显示,在保持其它因素不变的条件下,通气量9 L/min时菌丝体生物量最高,达到15.42 g/L,通气量6 L/min时胞内多糖得率最高,为2.10 g/L。根据实验结果提出如下控制策略:发酵前期0h到31.2 h通气量为6 L/min;发酵中期31.2 h到43 h通气量9 L/min;发酵中后期43 h到55 h通气量6 L/min;发酵后期55 h至结束通气量为5 L/min,结果得出菌丝体生物量最大值达到16.35 g/L,比最优通气量9 L/min提高了6.03%,胞内多糖得率最大值达到2.24 g/L,比最优通气量6 L/min提高了6.67%。3、G0119菌丝体胞内多糖液体深层发酵工艺优化以高产G0119菌丝体胞内多糖为目标,首先,通过对G0119液体发酵培养基中碳源、氮源和磷酸盐的筛选,确定出最佳种类分别为葡萄糖,酵母粉01,磷酸二氢钾。其次,通过单因素实验与Box-Behnken响应面法对发酵培养基中葡萄糖、酵母粉01、磷酸二氢钾、发酵液p H和接种量进行优化,确定出最佳的工艺条件为:葡萄糖40 g/L,酵母粉01 12 g/L,磷酸二氢钾3 g/L,发酵液p H为5.5,接种量为10 m L/100 m L。在这种最优参数下胞内多糖得率的预测值为2.03 g/L,摇瓶实验验证结果为1.98 g/L,相差2.46%。在6 L发酵罐中做进一步扩大培养,菌丝体生物量达到25.31 g/L,胞内多糖得率达到2.59 g/L,高于预测值27.59%。结合6 L发酵罐通气量优化结果,50 L发酵罐中,菌丝体生物量最大值达到25.20g/L,胞内多糖得率最大值达到2.65 g/L,与6 L发酵罐实验结果相一致。表明该优化工艺有效的促进了G0119菌丝体胞内多糖的高产,该工艺是切实可行的。4、G0119液体深层发酵胞内和胞外多糖对巨噬细胞活性的影响采用HPSEC-MALLS-RI对G0119液体深层发酵获得胞内多糖和胞外多糖进行分析,胞内粗多糖分析图谱中组分1的重均分子量为4.695×10~6道尔顿,质量分数为58%,胞外粗多糖中组分2的重均分子量为5.554×10~4道尔顿,质量分数为94.9%。活性测试结果显示,两种粗多糖样品均具有体外刺激巨噬细胞释放NO的活性,且呈现出一定的浓度依赖性。