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硝酸盐同化作用是氮循环一个重要环节,其中硝酸盐还原成亚硝酸盐是同化作用的第一个氧化还原反应,微生物在这个过程中发挥了关键作用。目前已报道有两套典型的硝酸盐同化途径,分别是棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)中由双组份NasST调控的硝酸盐同化系统和产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)中由NasR调控的硝酸盐同化系统,两套系统的信号响应及调控机制差异明显。施氏假单胞菌A1501(Pseudomomas stutzeri A1501)是一株根际联合固氮菌模式菌株。该菌不仅能在微好氧条件下固氮,也可在厌氧条件下以硝酸盐为电子受体进行反硝化固氮,同时还具有较强的硝酸盐同化能力。基因组分析表明A1501同时含有NasST和NasR两类调控蛋白,但两套调控蛋白的功能及其调控机制尚不清楚。本研究采用5’RACE、RT-qPCR和启动子融合表达分析等方法,研究了nasST和nasR基因的编码区特征及启动子转录特性,主要结果如下:1.分别测定了不同温度和pH梯度条件下,A1501以硝酸盐或亚硝酸盐为唯一氮源的生长曲线,结果表明A1501在37℃、pH8.0条件下长势最佳。此外,测定了A1501在不同浓度梯度亚硝酸盐为唯一氮源条件下的生长曲线,结果表明A1501在6 mM以上的亚硝酸盐中生长变弱,推测高浓度的亚硝酸盐对细胞有毒性;比较了A1501野生型及氮调控关键基因ntrC和nifA突变株的硝酸盐同化能力,结果发现,nifA突变株的生长比野生型略有增强,但ntrC突变株完全丧失了硝酸盐和亚硝酸盐的利用能力,RT-qPCR分析表明,ntrC突变株中硝酸盐、亚硝酸盐转运蛋白编码基因nasA与nasF、硝酸盐还原酶编码基因nasB均下调95%以上;此外,调控基因nasR下调了70%,双组份调控系统基因nasS下调40%,表明A1501菌的硝酸盐同化途径受NtrC蛋白的调控。2.利用5’RACE方法分别确定了nasST和nasR的转录起始位点,在此基础上构建了不同长度DNA片段的启动子-lacZ融合表达载体,通过比较不同载体的β-半乳糖苷酶活性确定了nasST和nasR的启动子区间,即nasST的启动子区间为-272至+1区,nasR的启动子区间为-315至+1区;分析了nasST和nasR启动子的序列特征,结果表明nasST和nasR基因的启动子均存在3个可能的NtrC保守结合位点以及一个可能的RNA聚合酶σ因子RpoN保守结合位点。3.分别测定了不同氮源条件下nasST和nasR基因启动子-lacZ融合表达载体的β-半乳糖苷酶活性,结果表明,nasST基因的表达不受氮源影响,而nasR基因仅在硝酸盐和亚硝酸盐条件下诱导表达,在铵离子条件下低水平表达;进一步测定了NtrC和RpoN结合位点缺失(突变)对nasST和nasR启动子活性的影响,结果表明nasST启动子上-39至-19区的NtrC结合位点可能是转录激活所必须,而nasR启动子在-291至-275区的NtrC结合位点是转录激活所必须;RpoN保守结合位点的突变不影响nasST启动子活性,但导致nasR启动子丧失转录活性。综上所述,A1501存在两套不同的硝酸盐调控系统NasST和NasR,nasST基因的表达不受氮源影响,其启动子是非σ54依赖型;nasR的表达受硝酸盐和亚硝酸盐诱导,受铵抑制,其启动子为NtrC和RpoN依赖型。本研究为阐明A1501硝酸盐同化系统的网络调控机制奠定理论基础。