兔出血症,又称兔瘟,是由兔出血症病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种以急性、高度传染性、大面积死亡为特征的兔传染病。国际兽医局将该病列为B类传染病,我国农业部第1125号公告颁布为二类疫病。目前该病的主要预防措施是使用组织灭活疫苗免疫,然而用于制作该疫苗的非免疫兔来源很不确定,同时存在由于灭活不完全而产生散毒的潜在危险,生物安全性差,需要探索新的疫苗生产途径。本研究对利用重组兔出血症病毒杆状病毒制备的兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗开展研究,进行生产工艺研究后中试生产10批次疫苗,并在农业部行政审批许可后进行了疫苗临床试验,完成中试产品安全试验、效力试验和生物安全试验,最终兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)获得一类新兽药证书。对重组兔出血症病毒杆状病毒进行转瓶培养和悬浮培养工艺研究。结果显示,在中试生产和规模化生产时,培养条件控制在温度27～28℃、pH值为6.0～6.2、转速15 r/min。当细胞浓度约为2×106个/mL时按总体积的1%接毒,以相同条件继续培养,连续观察5日,待细胞病变达约85%以上时,可以收获细胞培养物。按照《兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)制造及检验试行规程(草案)》和中试生产方案,2013年2月至2013年7月在南京天邦生物科技有限公司进行中试生产,连续生产10批次,并按照现行《中国兽药典》附录对疫苗进行检测。结果显示,中试产品性状、装量检查、无菌检验、甲醛残留量测定、安全检验、效力检验等项目均符合标准。中间试制生产及检验结果表明,该疫苗生产工艺比较合理,产品质量稳定,适合进行规模化生产。选择3批次中试产品分别在六家临床试验兔场对不同品种、不同日龄家兔进行安全性研究。用疫苗对肉兔、獭兔、毛兔三个品种,健康易感家兔(2月龄兔)、最小使用日龄35日龄幼兔、非使用日龄20～30日龄仔兔以及怀孕20～25日母兔进行单剂量、单剂量重复接种和超剂量(2倍剂量)接种试验。结果显示,疫苗免疫不同品种、不同日龄家兔在14日观察期内均健活,接种疫苗后60天,剖检注射部位未见炎症反应,疫苗吸收良好;对35日龄幼兔进行超剂量接种生产性能测定试验,结果显示,该疫苗对家兔的生产性能无影响;分别采集免疫兔组织、排泄物以及免疫兔生存环境样本进行检测,结果显示,重组杆状病毒在受试兔肝、肺、肌肉、皮毛、粪便、尿液均没有残留,重组杆状病毒也没有向免疫兔生存环境的地面、土壤、空气中转移。以上结果表明,兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)安全检验合格,疫苗生物安全性良好,安全等级为Ⅰ级,尚不存在危险。选择3批次产品分别在六家临床试验兔场对不同品种、不同日龄家兔进行免疫效力评价,并用HI和ELISA方法检测兔出血症病毒抗体。结果显示,六家临床试验兔场试验期间均没有发生兔出血症;免疫持续期攻毒试验结果显示,疫苗对肉兔、獭兔、毛兔免疫期均可以达到7个月;兔出血症病毒抗体HI效价和ELISA方法OD450nm值可以在较高范围维持7个月。以上结果表明,兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)效力检验合格,免疫期为7个月。