【摘 要】
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衰老是自然界每个个体生命的必经历程,皮肤是生物体最大的器官,也是机体衰老过程中表现最为明显的器官之一。皮肤衰老受时间和环境因素的影响,很大程度上是受紫外线辐射累积的影响,长时间暴露于UV中会引起皮肤DNA损伤,从而引起细胞衰老、皮肤病甚至皮肤癌等疾病。皮肤作为免疫的第一道屏障,对动物的健康有重要的作用。脂肪间充质干细胞（Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs）来源丰富,是
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衰老是自然界每个个体生命的必经历程,皮肤是生物体最大的器官,也是机体衰老过程中表现最为明显的器官之一。皮肤衰老受时间和环境因素的影响,很大程度上是受紫外线辐射累积的影响,长时间暴露于UV中会引起皮肤DNA损伤,从而引起细胞衰老、皮肤病甚至皮肤癌等疾病。皮肤作为免疫的第一道屏障,对动物的健康有重要的作用。脂肪间充质干细胞（Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs）来源丰富,是具有极大应用前景的干细胞,已被证明了可以通过旁分泌机制与周围细胞进行信号传导从而对组织发挥修复作用。为研究犬ADSCs的抗皮肤衰老作用,本实验以老化皮肤成纤维细胞和大鼠光老化皮肤模型为对象,研究ADSC条件培养液（ADSC-Conditioned Medium,ADSC-CM）及其脂质体的抗衰老作用及机制。结果如下:1.ADSCs的生物学特性及其对皮肤成纤维细胞的抗衰老作用。采用I型胶原酶消化法分离培养幼犬腹部脂肪中的细胞,发现其呈纤维状贴壁生长,排列有序,生长速度较快,可被定向诱导分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45和HLA-DR,提示获得的细胞是ADSCs。分别使用CCK-8法、SA-β-Gal试剂盒、SOD检测试剂盒、ROS流式检测、Annexin V流式检测和QPCR法测定ADSC-CM处理后皮肤成纤维细胞活性、细胞衰老、氧化水平、凋亡和基因表达水平的变化。结果显示,ADSC-CM可显著提高老化成纤维细胞活性,降低衰老细胞数,提高SOD含量,降低ROS含量,并抑制皮肤成纤维细胞凋亡的发生。ADSC-CM处理后皮肤成纤维细胞的I型胶原蛋白和弹性纤维蛋白表达均显著升高,也抑制MMP-1、p16、p53的表达,同时核转录因子NF-κB表达降低,自噬发生相关的基因Beclin1和LC3B表达上升。结果表明ADSC-CM具有延缓皮肤成纤维细胞衰老的作用,且可能通过抑制其凋亡、增加自噬以及降低ROS含量而起作用。2.ADSC-CM及其脂质体对光老化大鼠皮肤的作用。为增加ADSC-CM的透皮吸收率,本项目使用乙醇注入法制备了ADSC-CM脂质体,透射电镜结果显示,ADSC-CM脂质体呈球形及类球形,相互间无黏连,分布均匀。采用激光粒度仪检测ADSC-CM脂质体粒径分布为0.363-2.512μm,平均粒径为1.065μm。采用超速离心法检测ADSC-CM脂质体包封率,计算结果可得其平均包封率为81.35%。采用UV照射法建立光老化大鼠皮肤模型,使用ADSC-CM和ADSC-CM脂质体对光老化皮肤涂抹3周,涂抹结束后,取皮肤进行检测。结果显示ADSC-CM脂质体组的GSH-PX、SOD、CAT活性均显著性提高,而ADSC-CM组只有CAT活性显著增加。ADSC-CM组及其脂质体组均能显著降低MDA和ROS含量。组织学观察发现造模后大鼠表皮增厚,真皮层出现胶原纤维疏松,胶原束断裂或排列紊乱,而经ADSC-CM或其脂质体处理后皮肤的胶原纤维断裂和紊乱情况有明显恢复,真皮厚度、胶原蛋白指数均显著升高,且ADSC-CM脂质体组的胶原蛋白染色面积显著高于ADSC-CM组。说明ADSC-CM能通过提高皮肤组织抗氧化能力延缓衰老,增加胶原蛋白的分泌,并且脂质体可能通过提高皮肤对ADSC-CM的吸收率从而发挥更好的效果。
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