抗舒伯特气单胞菌植物精油的筛选及对杂交鳢抗病力影响的研究

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舒伯特气单胞菌[Aeromonas schubertii,A.schubertii]是杂交鳢内脏“白点”病的病原菌,有很高的致死率,对杂交鳢的危害极大。目前,抗生素仍然是舒伯特气单胞菌病的首选药物。为减少抗生素在水产养殖中的使用,本论文以植物精油及舒伯特气单胞菌为切入点,研究了植物精油对舒伯特气单胞菌的体外抗菌作用及其对杂交鳢在体抗病效果的影响。本文从佛山市顺德区某养殖场选取有典型舒伯特气单胞菌病患病症状的杂交鳢进行病原菌分离鉴定,并以分离获得的病原菌株为指示菌,快速筛选出具有抗菌作用的植物精油。对筛选出的植物精油作进一步的抑菌机理分析,以及研究了植物精油混饲投喂杂交鳢后对其抗病力和MHCΙ(主要组织相容性复合体Ι)相对表达量的影响。具体研究内容及结果如下:1、舒伯特气单胞菌的分离鉴定从患病杂交鳢后肾分离获得一株优势菌,并命名为1907056。回归感染试验结果显示,所获得菌株对杂交鳢有很强的致病力,半致死浓度(LD50)为2.6×106CFU/m L,能引起与临床病例相似的症状。通过菌体形态观察、生理生化检测、16S r DNA和gyr B基因测序,将菌株1907056鉴定为舒伯特气单胞菌。通过测定细菌的OD600描绘该菌的生长曲线,结果表明,该菌生长极为迅速,其对数生长期为2~6 h,10 h后进入平台期。2、抑制舒伯特气单胞菌植物精油的筛选通过琼脂扩散法快速筛选具有抑菌活性的植物精油,并用二倍稀释法和平板涂布法测定筛选出的植物精油对菌株1907056的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)。试验结果表明,肉桂醛、牛至精油和单宁对试验菌都有抑制作用,其中肉桂醛的抑制作用最强,抑菌圈直径为(42.83±1.25)mm,MIC和MBC分别是0.1μL/m L和0.2μL/m L,说明肉桂醛对试验菌1907056的抑制作用极强。3、肉桂醛对舒伯特气单胞菌的抑制机理通过测定细菌培养液中碱性磷酸酶(AKP)活性、胞内代谢酶活性、蛋白质含量以及基因组DNA电泳图谱研究肉桂醛对舒伯特气单胞菌细胞壁、细胞膜以及DNA的影响。结果发现肉桂醛可改变菌体细胞壁、细胞膜的通透性,并引起DNA分子的断裂,最终导致细菌死亡。4、饲料中添加肉桂醛对杂交鳢抗病力以及MHCΙ表达的影响将肉桂醛混料拌匀后,对健康杂交鳢进行为期35 d的饲养实验。饲养结束后,用舒伯特气单胞菌对杂交鳢进行攻毒,结果表明饲料中添加0.04%和0.08%的肉桂醛能显著提高杂交鳢对舒伯特气单胞菌的抗病力,其攻毒后存活率分别为(66.67±4.71)%和(70.00±8.16)%。此外,高剂量的肉桂醛还能显著促进MHCΙ在肝脏及肾脏中的表达量,但抑制了其在脾脏中的表达。综上,肉桂醛对舒伯特气单胞菌有较强的抑制作用,而且对杂交鳢的抗病力及MHCΙ的表达有积极的影响,可作为水产新型药物开发的新方向。
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