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双酚A (Bisphenol A, BPA)是一种广泛使用于塑料制品的环境内分泌干扰物。BPA能经由食品以及饮料进入到人体,也可以从垃圾渗析到周围的生态环境中而对健康产生危害。大量研究发现BPA能够影响激素的合成和代谢,受体的表达以及基因的活性,然而以往的研究多集中在其雌激素活性上。本实验室前期研究发现无论是围生期、青春期还是成年期BPA暴露均性别依赖性地损伤雄性小鼠的空间学习记忆以及被动回避记忆能力。与雌激素对雌性动物的重要作用一样,雄激素对雄性的认知功能以及突触形成具有重要的调节作用。近来研究发现BPA能拮抗雄激素受体(AR)介导的转录活性。所以,本实验旨在探究BPA暴露性别特异性地损伤雄性小鼠学习记忆行为是否与其干扰雄激素对雄鼠学习记忆的调节作用有关。突触可塑性与空间学习记忆行为密切相关。性激素能通过影响海马和前额叶皮层中枢神经系统的突触重塑而影响认知行为。有研究发现睾丸摘除导致雄性小鼠海马突触密度降低,在补充丙酸睾酮(TP)或二氢睾酮(DHT)后,突触密度显著增加。突触界面是一个对化学物质非常敏感的结构,突触间隙、突触活性带长度、突触后致密物(postsynaptic density, PSD)和突触界面曲率等可因外界刺激而发生改变。PSD上分布着大量的脚手架蛋白以及一些与突触传递相关的调节蛋白,其中很多是与后膜上受体通道相关联,这些蛋白表达水平的改变以及彼此间的相互作用都能影响突触的活性和突触可塑性,同时也导致PSD厚度的变化。本研究通过建立成年去势雄鼠模型,将性腺完整、去势、去势后补充雄激素的雄鼠分别暴露于BPA,研究长期BPA暴露对成年雄鼠学习记忆行为的影响,进一步电镜观测雄鼠海马CA1区神经元的突触密度以及突触界面结构的改变；最后通过Western blot检测海马突触蛋白Synapsin Ⅰ和PSD-95,兴奋性氨基酸NMDA受体以及信号通路蛋白ERK1/2、p38及其磷酸化表达的改变,探讨BPA暴露影响雄鼠空间学习记忆行为和突触可塑性的可能机制。研究方法：清洁级8周龄的ICR雄性小鼠,购买于浙江医学科学院实验动物中心。饲养的环境为自然光照和黑暗12h交替,饲养室的温度控制在23±2℃，50%-60%的湿度控制,水以及食物均能自由取食。适应环境一周后,水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉,然后进行睾丸摘除术建立去势模型。术后恢复2周之后,每天进行颈背部皮下注射染毒：丙酸睾酮(TP,0.5 mg/kg/day), BPA(0.4,4 mg/kg/day), TP+BPA(0.4或4 mg/kg/day),金龙鱼食用油(50μL/day),为期45天。给药结束3天后,每组取14只进行行为检测,6只制作海马超薄切片进行海马突触形态测定,4只用于测定相关蛋白,8只用于测定脑和血清雄激素水平。实验所有的数据以平均值士标准误显示,用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。水迷宫4天训练结果采用重复三因素方差分析,水迷宫第5天结果、突触形态测定结果采用双因素方差分析,雄激素水平以及Western blot的蛋白结果采用单因素方差分析。研究结果：1.与假手术对照组相比,性腺摘除显著降低血清和脑内雄激素水平(p<0.001；p<0.001),当补充TP后,血清和脑雄激素水平上升(p<0.001；p<0.001)。BPA(0.4,4mg/kg/day)暴露不影响性腺摘除鼠血清和脑中雄激素水平,但是显著降低假手术组小鼠血清(p<0.05；p<0.01)和脑(p<0.05；p<0.01)雄激素的水平和TP补充小鼠血清(p<0.05)和脑(p<0.05；p<0.01)雄激素水平。2.水迷宫4天的训练结果表明：与假手术对照组相比,性腺摘除显著延长第4天小鼠找到平台的潜伏期(p<0.05),TP补充后,找到平台的潜伏期缩短(p<0.05),表明雄激素缺失明显损伤空间学习能力。BPA暴露没有延长去势小鼠找到平台的潜伏期(p>0.05),但显著延长假手术组(4 mg/kg/day, p<0.01)和TP补充组(0.4 mg/kg/day, p<0.05)小鼠找到平台的潜伏期。水迷宫第5天的结果表明,BPA暴露降低假手术组小鼠(0.4 mg/kg/day, p<0.05)和TP补充组小鼠(p<0.001；p<0.01)在目标象限停留的时间百分比,但不影响睾丸摘除小鼠目标象限停留的时间百分比。这些结果表明BPA损伤成年小鼠空间记忆能力,能抑制雄激素对性腺摘除诱导的空间记忆损伤的恢复作用。3.突触密度结果显示,性腺摘除显著降低成年雄鼠海马CA1区突触密度(p<0.001),TP补充后突触密度显著提高(p<0.001)。BPA (0.4,4mg/kg/day)暴露降低假手术组海马CA1区突触密度(p<0.001,p<0.001),但对性腺摘除组没有影响。BPA (0.4,4 mg/kg/day)暴露抑制TP诱导的突触密度增多(p<0.01,p<0.001)。与假手术对照组相比,性腺摘除显著缩短活性带长度(p<0.01),减小PSD厚度(p<0.001),增大突触间隙宽度(p<0.001),但TP补充后这种变化被BPA逆转(p<0.05,p<0.05,p<0.001)。BPA暴露对假手术组突触结构的影响与TP补充组相似。这些结果表明BPA暴露能抑制雄激素的诱导的海马突触的形成和结构修饰。4.进一步的Western blot分析显示,BPA尤其在4 mg/kg/day的剂量,显著下调假手术组小鼠海马synapsin Ⅰ (p<0.05), PSD-95 (p<0.01), NR2B (p<0.05)的表达。性腺摘除微弱下调synapsin I,但显著下调PSD-95 (p<0.05), NR2B(p<0.01)的表达,在补充TP之后这些蛋白表达上调(p<0.05,p<0.05)。BPA暴露抑制TP诱导对synapsinⅠ (p<0.01), PSD-95 (p<0.05), NR2B (p<0.05)的上调作用。进一步分析发现,性腺摘除和BPA暴露对p38和ERK1/2的表达没有影响,但是4 mg/kg/day的BPA暴露显著下调ERK1/2的磷酸化(p-ERK1/2)水平(p<0.05)并上调p-p38的磷酸化(p-p38)(p<0.001)。BPA暴露抑制TP诱导的p-ERK1/2上调(p<0.01)和p-p38下调(p<0.01)。这些结果表明BPA暴露抑制雄激素诱导的突触蛋白和NR2B的表达,抑制MAPK/ERKs并促进MAPK/p38信号通路的活性。结论：长期暴露于BPA性别特异性地损伤雄性动物的学习记忆功能可能与BPA的抗雄激素作用有关。该作用可能一方面通过降低脑内雄激素水平,并干扰雄激素对ERKs和p38信号通路的活性而下调突触蛋白和NMDA受体水平,负性改变海马神经元的突触可塑性,最终损伤学习记忆功能。