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研究背景:精子发生于睾丸中,是一个高度复杂的生殖细胞分裂和分化过程,并最终产生精子。精子需要从睾丸中的生精上皮脱离,进入附睾中进一步成熟和获得运动能力,而精子离开生精上皮的过程称为精子释放(Spermiation)。精子释放障碍可以导致无精子症。对精子释放的研究可以为治疗不育不孕乃至男性避孕药的开发提供理论依据。精子变形释放是一个保守的过程,以小鼠为例,精子变形过程分为16步,第16步精子主要位于Ⅶ-Ⅷ期生精时相的管腔中,这个阶段的精子开始进入最终的残余细胞质脱落和精子释放过程。精子释放过程由精子细胞和Sertoli细胞(支持细胞)共同参与,同时在睾丸中存在着一种保守的生殖细胞-支持细胞连接叫做顶端 ES 连接(apical ectoplasmic specialization junctions),与精子释放密切相关。顶端ES连接是一类基于睾丸支持细胞(Sertoli细胞)的微丝束(actin filament bundles),包含Sertoli细胞膜、内质网和细胞膜相关的Espin等多种蛋白质共同组成的复合体结构,将精子锚定于Sertoli细胞表面。在精子释放过程中,生精小管中一系列超微结构呈现动态变化:精子细胞头部形态重塑、顶端ES连接解离、支持细胞胞质回缩等。然而在精子释放过程中ES连接组分,特别是组分蛋白质是如何降解并移除,是否存在“开关”分子控制这一过程等科学问题依然急需解答。在真核细胞内,自噬和泛素化依赖的蛋白酶体降解通路被认为是主要的蛋白质降解通路。其中泛素化依赖的蛋白酶体降解通路被认为可以特异性识别靶蛋白进行精确调控,随着精子发生过程相关蛋白质功能研究的深入,越来越多的研究提示泛素化在精子发生过程中起到了精密的调控作用。我们关注到一个在睾丸中泛素化相关蛋白FBXO7,其参与组成了经典的E3泛素连接酶SCFFBXO7复合体,可能在睾丸中通过靶向识别特定的底物发挥泛素化作用,参与精子释放的过程。研究方法与结果:首先我们通过Realtime PCR发现Fbxo7基因在小鼠中为多组织表达基因,通过检测Fbxo7在发育各周龄小鼠睾丸中表达水平发现,其在3-4周小鼠睾丸中表达明显增加。通过Fbxo7基因敲除小鼠,深入探索FBXO7蛋白的功能。Fbxo7基因敲除(Fbxo7-/-)小鼠雄性不育,附睾尾没有精子,睾丸表型为Ⅷ期精子释放障碍,未释放精子发生凋亡,而睾丸体重比未见异常,激素水平正常;Fbxo7生殖细胞条件性敲除(Fbxo7F/F Stra8-Cre)小鼠雄性不育,附睾尾有少量精子,睾丸精子释放障碍,未释放精子发生凋亡;Fbxo7支持细胞条件性敲除(Fbxo7F/F AMH-Cre)小鼠雄性可育,附睾尾精子数量正常,睾丸表型正常;进一步观察Fbxo7-/-睾丸电镜,发现未释放精子的ES连接仍然存在;通过睾丸石蜡切片免疫荧光观察ES 蛋白,发现 Palladin、Drebrin、ARP3、β-Catenin、EPS8、Espin 在未释放精子处均有信号,而Espin的信号明显增强,且Western Blot检测也发现睾丸中Espin的表达量增多,而Espin的mRNA表达水平无变化,提示Espin蛋白表达的改变并非由于转录水平改变导致的。进一步通过Fbxo7F/FStra8-Cre的电镜也发现未释放精子ES结构仍然存在,未释放精子的Espin表达量增多。这些结果表明生殖细胞缺失Fbxo7基因后,顶端ES连接蛋白Espin异常增多导致精子释放障碍。为进一步解析FBXO7是如何调节Espin在睾丸中的表达水平,我们制备了FBXO7特异性抗体,进而通过内源性免疫共沉淀,我们发现睾丸内FBXO7可以与SKP1相互作用,提示FBXO7在睾丸中可以参与组成E3泛素连接酶SCFFBXO7复合体;同时发现FBXO7可以与Espin相互作用,睾丸内泛素化实验也证实了 FBXO7蛋白敲除后,睾丸Espin的泛素化水平降低,这可能导致Espin的蛋白降解减少,从而使蛋白水平升高。这些结果提示FBXO7通过参与Espin的泛素化,从而调节Espin的蛋白降解过程。缺失FBXO7是如何导致apical ES连接组分Espin降解异常的?我们进一步应用免疫荧光技术观察FBXO7定位情况,发现FBXO7主要出现于长形精子阶段,并于Ⅶ时相开始与Espin出现共定位;进一步通过超高分辨率显微镜观察,发现FBXO7在Espin存在的apical ES连接上存在点状分布。生殖细胞缺失Fbxo7基因可以导致Sertoli细胞中Espin蛋白降解异常。全睾丸缺失了 FBXO7后发现Espin信号增强,而生殖细胞缺失了 FBXO7后发现Espin信号增强,同时Sertoli细胞缺失FBXO7后发现Espin信号没有改变。进一步探究此现象,发现FBXO7可以借由精子释放起始阶段的特殊通道结构TBC,进入Sertoli细胞发挥功能。这些结果提示FBXO7在Ⅶ时相通过直接与Espin相互作用参与Espin降解过程。为了进一步验证这一假说,我们应用HEK293T细胞模型探索FBXO7与Espin的调节关系。我们首先通过过表达FBXO7和Espin,发现在HEK293T细胞中两者呈负相关;分别抑制自噬溶酶体通路和蛋白酶体通路后,发现Espin的表达量仅受蛋白酶体调控;应用放线菌酮处理,MG132抑制蛋白酶体降解,内源性干扰FBXO7后,发现Espin的表达量升高,半衰期延长,而过表达FBXO7后,Espin半衰期变短;此外内源性干扰FBXO7后,Espin的泛素化水平降低;FBXO7过表达后,Espin的泛素化水平增加;这些结果提示FBXO7表达量增加导致Espin稳定性降低。进一步观察FBXO7对Espin多聚泛素链形成的影响,发现FBXO7介导Espin形成K48位的多聚泛素化链,从而介导了 Espin的泛素化降解;通过体外泛素化体系,进一步证实了 FBXO7介导了 Espin的多聚泛素化。总结:综上所述,我们发现精子释放过程受控于FBXO7。在长形精子变形末期,FBXO7通过与ES组分Espin相互作用,导致其泛素化进而被蛋白酶体降解,启动精子释放。这是新发现的一个直接调控精子释放的“开关”蛋白质,我们首次阐明精子释放中生殖细胞和体细胞(Sertoli细胞)间的细胞连接是通过泛素化进行精确的靶向调控。这一发现填补了生殖生物学中精子释放机制缺失的关键一环,同时也为临床不育症的诊疗和男性避孕药的开发提供了新的靶点。