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目的本研究拟建立游离脂肪酸诱导的非酒精性脂肪肝细胞模型,并探讨四逆散对其的治疗作用和治疗机制,以及糖皮质激素加重非酒精性脂肪肝的机制。方法1.采用1mM的游离脂肪酸诱导LO2细胞脂肪变性,分成空白对照组、模型组、四逆散水煎液组、辛伐他汀组四组。建立FFA诱导的非酒精性脂肪肝模型,测定细胞内甘油三酯和总胆固醇含量,评价四逆散的药效作用。采用ELISA法检测细胞上清液中IL-6、IL-18、TNF-α和IL-1β的炎症因子分泌水平。采用RT-PCR和Weston Blot法检测细胞内NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA和蛋白表达水平。进而探索四逆散通过NLRP3/IL-1β通路对非酒精性脂肪肝的治疗机制。2.采用1mM的游离脂肪酸诱导LO2细胞脂肪变性,分成空白对照组、FFA模型组、GC+FFA复合模型组、四逆散水煎液组四个组。建立FFA诱导的非酒精性脂肪肝模型,测定各组细胞内甘油三酯和总胆固醇含量,观察糖皮质激素加重肝细胞脂质累积情况。采用ELISA法检测细胞上清液中IL-6、IL-18、TNF-α和IL-1β的炎症因子分泌水平。采用PT-PCR和Weston Blot法检测细胞内NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA和蛋白表达水平。进而验证糖皮质激素通过NLRP3/IL-1β通路加重非酒精性脂肪肝的作用机制。结果1.四逆散对于FFA诱导LO2细胞脂肪变模型的作用:与正常组相比,模型组细胞内TC、TG含量明显增加,与模型组相比辛伐他汀组、四逆散高剂量组、四逆散中剂量组的TC、TG含量都有明显的降低,差异有统计学意义(P<0.05)。而四逆散低剂量组与模型组相比没有明显差异。2.GC+FFA诱导LO2细胞脂肪变模型的建立及四逆散的作用:采用ELISA法检测各组细胞上清液中IL-6、IL-18、TNF-α、IL-1β的含量。结果显示,FFA模型组和GC+FFA复合模型组与空白组相比,两个模型组细胞上清液中IL-6、IL-18、TNF-α、IL-1β的含量均显著增加。GC+FFA复合模型组与模型组相比,其细胞上清液中IL-6、IL-18、TNF-α、IL-1β的含量均显著增加。四逆散组与FFA模型组相比,四逆散组内IL-6、IL-18、TNF-α、IL-1β的含量均明显降低。采用RT-PCR法检测LO2细胞内NLRP3、caspase-1和ASC mRNA的表达。结果显示,与对照组相比,FFA模型组及GC+FFA复合模型组细胞内NLRP3、caspase-1和ASC的表达水平均明显增加。GC+FFA复合模型组与FFA模型组相比,GC+FFA复合模型组细胞内NLRP3、caspase-1和ASC的表达水平均明显增加。四逆散组与FFA模型组相比,细胞内NLRP3、caspase-1和ASC mRNA的表达显著降低。采用Western Blot法检测LO2细胞相关蛋白NLRP3、caspase-1和ASC的表达。结果显示,与对照组相比,FFA模型组及GC+FFA复合模型组细胞内NLRP3、caspase-1和ASC的蛋白表达水平均明显增加。GC+FFA复合模型组与FFA模型组相比,GC+FFA复合模型组细胞内NLRP3、caspase-1和ASC的蛋白表达水平均明显增加。四逆散组与FFA模型组相比,细胞内NLRP3、caspase-1和ASC mRNA的蛋白表达显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。3.四逆散对LO2细胞脂肪变模型NLRP3/IL-1β通路的干预机制:采用ELISA法检测上清液中IL-6、IL-18、TNF-α IL-1β的含量,模型组与空白组相比,模型组细胞上清液中IL-6、IL-18、TNF-α、IL-1β的含量均显著增加。四逆散组与模型组相比,四逆散组内IL-6、IL-18、TNF-α IL-1β的含量均明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。四逆散组与辛伐他汀组相比,上清液中各项指标表达水平差异均无统计学意义。采用Western Blot法检测LO2细胞相关蛋白NLRP3、caspase-1和ASC的表达。结果显示,模型组细胞内NLRP3、caspase-1和ASC的表达水平与对照组相比均明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。四逆散水煎液组与辛伐他汀阳性药组相比差异无统计学意义。与模型组相比,两个给药组的NLRP3、caspase-1和ASC的蛋白表达则明显降低。采用RT-PCR法检测LO2细胞内NLRP3、caspase-1和ASC mRNA的表达。结果显示,与对照组相比,模型组细胞内NLRP3、caspase-1和ASC的表达水平均明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。四逆散水煎液组与辛伐他汀阳性组与模型组相比,细胞内NLRP3、caspase-1和ASC mRNA的表达显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论1.四逆散可以降低脂肪变性细胞的甘油三酯和总胆固醇的分泌2.糖皮质激素可以通过上调NLRP3/IL-1β通路的基因表达,增加细胞炎症反应,加强细胞的胰岛素抵抗,从而加重非酒精性脂肪肝的炎症。3.四逆散水煎液可能通过下调NLRP3/IL-1β通路的基因表达,从而减少IL-6、IL-18、TNF-α等炎症因子的分泌,从而降低细胞的炎症反应,改善细胞的胰岛素抵抗,从而达到治疗非酒精性脂肪肝的效果。