蚕蛹多肽螯合钙的制备及其磷酸化改性研究

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多肽螯合钙稳定性好、生物利用度高,作为新一代补钙制剂,应用前景广阔。蚕蛹中蛋白含量丰富,且天冬氨酸(Aspartic acid,Asp)与谷氨酸(Glutamic acid,Glu)是比例最高的两种氨基酸,其丰富的羧基可提供与钙离子结合的位点,是制备多肽螯合钙的优质原料。本文以削茧蚕蛹为原料,优化建立了蚕蛹多肽螯合钙的制备工艺,利用磷酸化改性提高蚕蛹多肽与钙的结合能力,通过分析螯合反应中多肽的结构变化探索了肽钙结合机理,并通过模拟体外胃肠道消化实验,研究了蚕蛹多肽螯合钙的吸收性能及生物可及性,旨在为蚕蛹多肽螯合钙补钙制剂的开发提供技术支撑。本论文的主要研究成果如下:(1)蚕蛹多肽螯合钙的制备工艺及结构表征:将蚕蛹蛋白酶解后与CaCl2反应制备蚕蛹多肽螯合钙,以样品肽螯合钙中钙含量为指标,筛选出Alcalase酶为最佳蛋白酶,通过单因素实验和响应面工艺优化法确定了制备蚕蛹多肽螯合钙的最佳工艺条件:反应p H为10.0、反应温度73℃、反应时间80min、蚕蛹多肽:CaCO3质量比3.4:1时,得到的蚕蛹多肽螯合钙的含钙量可达到14.51%。进一步考察了不同分子量的蚕蛹多肽与钙离子螯合能力,利用超滤技术将蚕蛹多肽分级,发现分子量为1~3KDa的肽段螯合钙能力最强,所制螯合钙样品中钙含量可达到18.24%。紫外光谱分析发现,蚕蛹多肽与钙结合后最大吸收峰发生偏移;红外光谱分析表明,蚕蛹多肽中-NH2、-OH、-C=O、-COOH及羧酸酯基团和磷酸基团的结构有所改变,钙离子主要通过蚕蛹多肽的羧基和氨基、磷酸基团结合;通过扫描电镜观察,蚕蛹多肽与钙结合后表面变为疏松多孔,该结构的溶解性较好。(2)磷酸化蚕蛹多肽螯合钙制备工艺优化及结构鉴定:将蚕蛹多肽进行磷酸化改性后再制备多肽螯合钙,发现磷酸化多肽与钙结合能力更强,且与磷酸化程度有关。选择磷酸二氢钠为磷酸化试剂,通过单因素试验确定磷酸化处理条件为:磷酸二氢钠浓度0.5%、反应时间1h、反应温度40℃、反应p H为8.0时,进一步制备出的磷酸化蚕蛹肽螯合钙钙含量可达到22.72%。经过磷酸化位点检测,发现磷酸化处理可使蚕蛹酶解产物中的17种肽段被磷酸化,增加磷酸化位点22个,磷酸化修饰主要发生在丝氨酸(Serine acid,Ser)、苏氨酸(Threonine acid,Thr)两种氨基酸上。(3)多肽螯合钙体外模拟消化试验:通过对比CaCO3、葡萄糖酸钙,体外模拟消化试验发现,在模拟胃环境中,蚕蛹多肽螯合钙、磷酸化蚕蛹多肽螯合钙的释放率可达90%以上;模拟肠环境中,蚕蛹多肽结螯合钙、磷酸化蚕蛹多肽螯合钙在肠道中的沉淀较CaCO3、葡萄糖酸钙小;在食物共存成分草酸、植酸、膳食纤维的影响下,蚕蛹多肽螯合钙、磷酸化蚕蛹多肽螯合钙的可溶性钙比例整体高于CaCO3、葡萄糖酸钙。
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