【摘 要】
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目的:构建全人源单链抗体(single chain fragment variable,SCFV)噬菌体展示文库并对其进行滴度测定及多样性分析,通过亲和筛选获得亲和力高的靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白L858R位点突变单链抗体的序列。方法:1.收集10份正常人外周血,分离出外周血单个核细胞(peripheral blood m
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目的:构建全人源单链抗体(single chain fragment variable,SCFV)噬菌体展示文库并对其进行滴度测定及多样性分析,通过亲和筛选获得亲和力高的靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白L858R位点突变单链抗体的序列。方法:1.收集10份正常人外周血,分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)获取总RNA后反转录为互补DNA(complementary DNA,cDNA),再利用PCR等方法扩增出单链抗体重链可变区(variable of heavy chain,VH)和轻链可变区(variable of light chain,VL)基因拼接成单链抗体,并克隆入噬菌粒载体pComb3后电转化入大肠杆菌TG1,在辅助噬菌体及外包装作用下,建成全人源SCFV噬菌体抗体库;2.把EGFR-L858R作为靶标抗原利用酸洗脱法,经“结合一洗脱一扩增”步骤进行多轮淘选;3.筛选出的单克隆进行酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)鉴定,阳性单克隆送至测序公司进一步分析。结果:1.成功构建出库容量约为1×10~9的全人源SCFV噬菌体展示文库,文库阳性率及多样性等均合格。2.以EGFR-L858R蛋白为靶标抗原,利用酸洗脱法通过2轮富集筛选及初步鉴定得到10株阳性单克隆。3.对10株阳性单克隆进行测序分析得到6条靶向EGFR蛋白L858R位点突变的人源SCFV序列。结论:本研究成功构建出全人源SCFV噬菌体抗体文库,经过富集筛选及初步鉴定获得了靶向EGFR蛋白L858R位点突变单链抗体的序列。可进一步应用于相关恶性肿瘤的免疫治疗,为CAR-T疗法治疗实体肿瘤提供了新的思路及材料基础。
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