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猪2型圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征、圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated disease,PCVAD)等相关疾病的重要病原。PCV-2的ORF2基因不仅是其主要结构蛋白的编码基因,而且也是区分PCV-1和PCV-2的重要区域,其编码蛋白具有良好的抗原性。本研究利用PCR技术扩增出PCV-2 PDSH株和LY株ORF2基因,并进行了分子克隆,成功地实现了PDSH株ORF2基因在BHK-21细胞中的表达,并对表达的重组蛋白进行了初步鉴定。参照GenBank发表的PCV-2基因序列,设计合成一对引物,对PCV-2 PDSH株、LY株ORF2基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约719bp的特异条带,将其回收后克隆到pMD18-T easy载体进行测序,将所测序列与已公布的PCV-2 ORF2序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。通过扩增可以获得702bp的PCV-2 ORF2全基因,编码233个氨基酸,分子量为27995.93D。PCV-2河南分离株ORF2之间的核苷酸同源性为97.0-99.0%,氨基酸同源性为95.3-99.1%,其中LY株与GenBank中的XX株之间的核苷酸和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性达98.9%,氨基酸同源性达99.1%;和国内毒株相比,PDSH株与GenBank中的HZ株、LY株与GenBank中的HANGZHOU株同源性最高达99.3%;和国外毒株相比,LY株与国外的Denmark株的核苷酸同源性最高达99.6%,PDSH株与国外的Brazil株、Denmark株同源性最高达99.3%;LY株与Denmark株氨基酸同源性最高达99.6%,PDSH株与国外的Brazil株氨基酸同源性最高达,JZ株与PDSH株之间的同源性最低。根据基因分析,设计一对带有酶切位点的引物,利用此引物从克隆的pMD18-T-ORF2重组质粒扩增出含ORF2主要抗原位点的566bp区段,经BamH I和HindⅢ双酶切,将回收的ORF2基因定向插入真核表达载体pcDNA3.0,经BamH I和HindⅢ酶切、测序鉴定,得到阳性重组表达质粒pcDNA3.0-ORF2。将重组质粒pcDNA3.0-ORF2瞬时转染到BHK-21细胞中,转染后的细胞经RT-PCR检测到了PCV-2 ORF2基因的mRNA;经间接免疫荧光检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV-2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。结果表明:成功构建了克隆质粒pMD18-T-ORF2及其表达质粒pcDNA3.0-ORF2;pcDNA3.0/ORF2质粒在BHK-21细胞中进行了瞬时表达,在转染的BHK-21细胞中检测到PCV-2 ORF2基因的mRNA,表达的Cap蛋白可与PCV-2抗血清发生特异性反应。本研究成功构建了克隆质粒pMD18-T-ORF2及其真核表达质粒pcDNA3.0-ORF2;重组表达质粒在BHK-21细胞中瞬时表达了具有Cap蛋白生物学活性的蛋白。本研究为PCV-2的DNA疫苗的研究及其单克隆抗体的研究奠定了基础。