杨树C4H基因RNAi载体和UGPase基因过量表达载体的构建及其遗传转化研究

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木质素是维管植物次生细胞壁的主要成分,长期以来由于其降低牧草饲用品质,影响纸张和纤维生物质能源的生产而备受关注。木质素的数量和其反应活性一直是困扰纸浆生产的两个重要的障碍。经过近20年来对苯丙氨酸代谢调控途径的研究,目前木质素合成代谢过程中关键酶的研究比较清晰。肉桂酸4-羟基化酶(C4H)是一类催化香豆酸4’位置的羟基化并且依赖于NADPH的细胞色素P450单氧酶。RNAi技术是一种有效的在转录水平上降低目的基因表达的技术。本研究中,构建C4H基因RNAi载体,通过转基因技术抑制杨树细胞内C4H基因的表达,获得低木质素含量的杨树转基因植株。纤维素微纤丝参与到植物细胞壁的合成,也是制浆过程中所需要的成分。有关纤维素的合成了解的很少,相比较“酶促反应”,科学家更倾向于认为纤维素合成过程是“细胞生理反应过程”。目前有关纤维素合成的研究主要集中在纤维素合成酶(CesA)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶(UGPase)。有研究证明,过量表达UGPase基因可以显著增加植株的生物量和纤维素的含量。本研究中,通过构建UGPase过量表达载体,利用转基因技术提高细胞中UGPase的含量,获得高纤维素含量的杨树转基因植株。分别以南林95杨和南抗杨作为材料,构建了肉桂酸4-羟化酶RNAi载体pBI121+2F和尿苷二磷酸葡糖糖焦磷酸酶过量表达载体pBI121+UGPase。开展了农杆菌介导的遗传转化,并对转基因植株进行PCR检测。获得的主要结果如下:(1)利用RT-PCR技术从南林95杨中克隆到432bp大小的C4H基因片段,并成功构建了C4H基因的RNAi载体。从南抗杨中克隆到杨树全长的UGPase基因序列,全长共1410个碱基,编码469个氨基酸,成功构建UGPase基因的过量表达载体。(2)通过生物信息学分析,UGPase预测的分子量为51.64KD,等电点为5.56。EST表达分析显示该基因主要在花器官或其他顶端生长点组织表达。Pfam软件分析结果显示该酶具有一个明显的UDPGP结构域,运用3D-JIGSAW软件预测该酶的空间结构。UGPase家族进化分析显示,双子叶植物中该家族的保守性较单子叶植物低。(3)运用成功构建的UGPase过量表达载体进行农杆菌介导的杨树遗传转化,最终获得7株抗性苗,PCR初步确认其中有5株是转UGPase基因植株。综上所述,本研究成功从杨树中克隆C4H基因的部分序列和UGPase基因的全长序列,成功构建了C4H基因的RNAi载体。运用多种生物信息学软件,对UGPase基因进行比对、结构预测和进化树分析。成功获得5株过量表达UGPase基因的转基因苗,为进一步研究木质素和纤维素合成代谢奠定基础。
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