小肠是动物消化和吸收的重要器官，小肠黏膜是其发挥作用的关键部位。小肠上皮细胞向下移动凹陷后形成隐窝结构，大约6～10个隐窝支持一条小肠绒毛的生长与代谢。隐窝是小肠上皮细胞的生长源头，在隐窝的内部存在小肠干细胞和潘氏细胞。隐窝在小肠的更新中起着十分重要的作用。本实验采用低温酶消化并结合离子螫合剂的方法分离和纯化两周龄鸡小肠的隐窝，并将分离到的隐窝进行培养，然后检测隐窝的进行形态变化、标记基因表达和细胞增殖活性，旨在建立鸡小肠隐窝的分离和培养方法，为家禽小肠更新和功能的研究提供实验技术平台。　　1，小肠隐窝的分离和培养　　小肠隐窝是小肠上皮细胞下陷而形成的特殊壁龛样的结构，在隐窝中存在特殊的小肠上皮细胞如潘氏细胞和小肠干细胞。本实验以两周龄的海兰鸡小肠作为材料，通过低温物理方法，在离子螯合剂中孵育小肠片段以分离隐窝。刚分离得到的大量绒毛碎片以及单个细胞在孵育振荡后显微镜下检查，可观察到绒毛-隐窝单位，更换新的分离液后继续孵育隐窝，可得到大量小肠隐窝。用200目筛网过滤以及梯度离心的方法纯化隐窝，显微镜下检查计数，每只雏鸡可获得15000个左右结构完整的隐窝。将分离的隐窝按200个左右/50μl液体的密度接种到Matrigel立体培养基中，同时加入三组不同浓度的添加物，包括表皮生长因子(EGF)、Noggin和R-Spondin，然后观察隐窝的生长情况，最终确定隐窝培养基的成分为500μg/ml EGF、100μg/ml Noggine和1000μg/ml R-spondin。隐窝在体外可以生长达到9d，并且保持结构完整，隐窝直径从80μm增大到200μm以上，增幅达200％以上。　　2，培养的鸡小肠隐窝特性的研究　　鸡小肠隐窝体外培养会形成规则的球体。透射电镜观察结果表明，培养的隐窝结构完整。干细胞标记物Ascl2、Znrf3、Olfm4、Lgr5、HopX的mRNA表达检测结果显示，培养的隐窝可表达上述所有小肠千细胞的标记基因。中性红染色结果显示，培养的隐窝被染成红色，说明培养的隐窝具有良好的活性;5-Ethyny1-2-deoxyuridine掺入实验表明，隐窝中存在部分阳性细胞，这些阳性细胞是增殖的细胞。添加CHIR99021（Wnt通路中糖原合成激酶GSK3β的阻断剂）后发现，隐窝增长速度加快，体积变大，最大直径达到300μm。以上结果表明，本实验培养的隐窝不仅可以在体外维持存活，细胞具有增殖活性，而且可对刺激物CHIR99021的处理有应答。　　综上所述，本实验建立了鸡小肠隐窝的分离和培养方法，培养的隐窝可形成球形结构、表达干细胞标记基因Ascl2、Znrf3、Olfm4、Lgr5和HopX维持细胞的增殖活性，并可对外界刺激物作出反应，说明本实验所建立的雏鸡小肠隐窝的培养模型可用于小肠更新和功能的研究。