目的:糖脂代谢异常及其相关糖尿病和心血管疾病现已成为危害人类健康的主要原因,患者常表现为胰岛素抵抗及血脂异常沉积,其中胰岛β细胞和血管内皮细胞功能损伤是其发生发展的关键,但发病分子机制目前尚不完全明确。近期大量研究显示,微小核糖核酸(micro RNA,mi RNA)在糖脂代谢异常及2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)、血管内皮细胞损伤中发挥重要作用。本课题组的前期研究显示,人外周血循环中也存在丰富、稳定表达mi RNA,是一类新型疾病生物标志物,但糖脂代谢异常及其相关的T2DM微血管并发症(type 2 diabetes microvascular complications,T2DMC)人群中循环mi RNA研究报道较少,循环mi RNA作为糖脂代谢异常人群新型生物标志物价值、生理功能及参与糖脂代谢异常相关疾病分子机制尚不明确。因此本论文研究目的主要有以下几个方面:一、筛选高糖高脂患者血清mi RNA表达谱,分析其作为糖脂代谢异常患者疾病发生发展潜在的风险预测分子指标潜能。二、检测T2DM及T2DMC患者血清中胰岛和内皮功能损伤相关mi RNA水平及表达特征,探讨特定变化mi RNA存在形式及临床价值,评估其作为T2DM及T2DMC患者新型辅助生物标志物潜能。三、体外构建高糖高脂诱导血管内皮细胞损伤模型,检测T2DM及T2DMC患者特定变化的mi RNA在细胞中表达变化情况,预测mi RNA内皮细胞功能相关靶基因,初步探讨特定mi RNA通过调控其靶基因表达参与高糖高脂诱导内皮细胞损伤分子机制。方法:一、收集高糖、高脂、高糖高脂患者及健康对照血清样本各30例,通过基于锁核苷酸(Locked Nucleic Acid,LNA)技术的Exiqon mi RNA芯片技术测定高糖高脂患者血清mi RNA表达谱,初筛芯片中患者与对照显著变化mi RNA,并选取部分文献报道mi RNA,进一步运用实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)在上述样本中对初筛mi RNA水平进行复筛和验证,筛选高糖高脂患者显著变化血清mi RNA,最后通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)、逻辑回归分析方法分析其作为疾病发生发展潜在的风险预测分子指标价值。二、收集131例T2DM、131例T2DMC及129例健康对照人群血清标本,运用q RT-PCR检测T2DM、T2DMC患者及健康对照血清中血管内皮细胞和胰岛β细胞高表达、功能相关多种mi RNA水平;生化分析仪测定患者及对照相关生化指标,进一步针对特定变化血清mi RNA,探究其存在形式,最后通过ROC曲线、逻辑回归分析上述血清mi RNA对T2DM及T2DMC的辅助诊断价值。三、构建高糖和高脂诱导血管内皮细胞损伤模型,光镜下观察细胞数量、形态变化;q RT-PCR检测T2DM及T2DMC患者血清变化的mi RNA在细胞中表达水平变化情况,并针对显著变化特定mi RNA,运用生物信息学方法预测其潜在靶基因,荧光素酶报告实验验证mi RNA与靶基因靶向调控关系,Western blot验证其在细胞模型中靶基因表达水平。结果:一、血清mi RNA芯片结果显示,高糖高脂人群血清mi RNA表达谱与对照具有明显差异;6种血清mi RNA(包括mi R-25-5p、mi R-4658、mi R-4773、mi R-4132、mi R-5771-5p和mi R-3165)在高糖高脂人群显著升高,2种mi RNA(mi R-130b和mi R-494-5p)显著降低(P<0.05);q RT-PCR对芯片mi RNA及文献报道mi RNA(mi R-103、mi R-107、mi R-33a、mi R-221、mi R-144和mi R-571)验证结果显示,mi R-33a在高糖(8.85±4.2)×10-3、高脂(25.14±4.9)×10-3及高糖高脂(21.18±5.4)×10-3患者血清中水平与对照相比(1.95±0.58)×10-3显著升高,ROC曲线分析结果显示mi R-33a作为高糖、高脂及高糖高脂患者诊断指标的曲线下面积分别为0.702(95%CI=0.535~0.87),0.975(95%CI=0.00~1.00)和0.913(95%CI=0.802~1.00);逻辑回归分析结果显示,血清mi R-33a是高糖、高脂及高糖高脂患者的危险因素[OR值分别为6.33(95%CI:0.67~60.16),P=0.108;171(14.24~2.05×103),P<0.001和76(7.7~750.5),P<0.001]。二、运用q RT-PCR技术对T2DM及T2DMC患者血清mi RNA水平测定结果显示,两组患者mi RNA水平分别为:T2DM[mi R-16=(23.74±2.70)×10-5,mi R-126=(25.01±4.13)×10-5,mi R-221=(84.76±11.79)×10-5和mi R-7=(173.8±33.77)×10-5]及T2DMC[mi R-16=(43.74±9.61)×10-5,mi R-126=(17.66±2.20)×10-5,mi R-221=(82.52±12.48)×10-5和mi R-7=(176.2±49.27)×10-5],显著高于健康对照[mi R-16=(14.35±1.00)×10-5,mi R-126=(11.75±1.47)×10-5,mi R-221=(32.26±3.98)×10-5和mi R-7=(67.47±8.44)×10-5](P均<0.05),可作为T2DM及T2DMC患者潜在的辅助诊断指标;进一步针对患者特定变化mi R-7存在形式研究显示,血清mi R-7主要以游离而非外泌体(exosome)包裹形式存在,且血清游离mi R-7对T2DMC患者诊断价值高于血清mi R-7。三、在高糖高脂刺激下,血管内皮细胞数量明显减少,形态也发生变化;高糖高脂可刺激mi R-661水平显著上升,生物信息学预测及荧光素酶实验结果显示过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)辅激活因子1α(PGC-1α)是mi R-661潜在的靶基因,Westernblot结果显示高糖高脂刺激可PGC-1α显著降低。结论:一、高糖高脂患者血清mi RNA表达谱与对照人群具有明显不同,患者血清中表达水平显著升高的mi R-33a可作为糖脂代谢异常患者疾病发生发展潜在的风险预测分子指标。二、T2DM及T2DMC患者血清中mi R-7、mi R-16、mi R-126和mi R-221表达水平与健康对照相比显著升高,是T2DM及T2DMC患者潜在的独立危险因素和非侵入的辅助诊断标志物,其中患者血清中显著变化mi R-7主要以游离形式存在,且游离mi R-7对T2DMC患者诊断价值高于血清mi R-7。三、高糖高脂可诱导血管内皮细胞数量和形态发生明显变化,并通过刺激上调胞内mi R-661水平抑制PGC-1α的表达。