论文部分内容阅读
目的:探讨复合菌种(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)益生菌的抗焦虑抑郁作用,分析其对肠道菌群结构及组成成分、血清和海马炎症因子,以及海马吲哚胺2,3-双加氧酶-1(indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1)的影响,从而探讨益生菌潜在的抗焦虑抑郁机制。方法:1、实验动物分组:采用慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)连续4周构建抑郁小鼠模型,益生菌选取的是复合菌种(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)冻干粉,以选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor,SSRI)氟西汀为阳性对照药物。6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为6组:慢性应激+安慰剂组(CUMS+NS),慢性应激+氟西汀组(CUMS+F),慢性应激+益生菌组(CUMS+P),对照+安慰剂组(CON+NS),对照+氟西汀组(CON+F)和对照+益生菌组(CON+P)。通过灌胃的方式给予对应的药物。CUMS+P和CON+P每日给予益生菌2×10~9 CFU(0.2 mL),CUMS+F和CON+F每日给予氟西汀18 mg/kg,CUMS+NS和CON+NS组每日给予生理盐水0.2 mL,慢性应激组给药的同时施加应激程序,对照小鼠除了喂食、清洁笼子和给予对应药物外,不给予其他任何应激。2、行为学测试:每周进行小鼠体重的测定;4周造模及药物干预结束后采用庶糖偏好实验、旷场实验、高架十字迷宫实验、强迫游泳实验,来评估小鼠焦虑抑郁样行为的变化。3、肠道微生物菌群分析:盲肠内容物利用16S rDNA测序,并进行beta多样性分析、alpha多样性分析和物种丰度分析,来评估小鼠肠道微生物菌落结构及组成的变化。4、炎症因子指标:采用ELISA法测定血清和海马组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素(interleukin,IL)-6、IL-10水平。5、海马吲哚胺2,3-双加氧酶-1(indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1)蛋白表达:采用Western-Blotting法检测海马IDO1蛋白表达水平。结果:1、4周CUMS诱导小鼠产生显著的焦虑抑郁样行为。与对照组相比,CUMS小鼠体重增长显著减慢(P<0.05)。4周CUMS造模后小鼠蔗糖偏好指数显著降低(P<0.05),旷场实验中CUMS使小鼠在中心区域停留时间明显减少(P<0.05);高架十字迷宫实验中小鼠进入开放臂停留时间显著缩短(P<0.05);强迫游泳实验的不动时间显著增加(P<0.05)。氟西汀干预可以完全逆转这种慢性应激引起的行为学变化,表现为:与CUMS+NS相比,CUMS+F组蔗糖偏好指数明显升高(P<0.05);旷场实验的中心区域停留时间显著增加(P<0.05);明显缩短了高架十字迷宫实验中的进入开放臂停留时间(P<0.05)以及强迫游泳时小鼠的不动时间(P<0.05)。益生菌(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)部分逆转了慢性应激引起的行为学变化,表现为:与CUMS+NS相比,CUMS+P组旷场实验的中心区域停留时间显著增加(P<0.05);明显缩短了高架十字迷宫实验中的开放臂停留时间(P<0.05)和强迫游泳时的不动时间(P<0.05),益生菌干预虽对蔗糖偏好指数无统计学差异,但有提高趋势。2、从beta多样性分析来看,CUMS使小鼠肠道菌群落结构发生显著改变。从alpha多样性分析来看,CUMS造模后指数Chao1和Simpson显著升高(P<0.05),肠道菌群具有更高的多样性和物种均匀性。另外分别在门、纲、目、科、属分类等级进行物种丰度的分析。结果显示:48个样品肠道微生物物种注释主要归属于4个门:分别是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和变形菌门(Proteobacteria),这4个菌门占到了总序列的(96.94±2.04%)。通过Kruskal-Wallis检验分析发现:CUMS对小鼠肠道菌群中厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门和变形菌门的相对丰度无显著影响。CUMS造模后,CUMS+NS与CON+NS相比,在纲水平,Bacilli相对丰度明显减少(P<0.05),而Erysipelotrichia和Betaproteobacteria相对丰度明显增加(P<0.05)。在目水平,Lactobacillales相对丰度明显减少(P<0.05),而Erysipelotrichales和Burkholderiales相对丰度明显增加(P<0.05);在科水平,Lactobacillaceae相对丰度明显减少(P<0.05),而Ruminococcaceae、Prevotellaceae、Erysipelotrichaceae、Rikenellaceae和Sutterellaceae相对丰度明显增加(P<0.05)。在属水平,Lactobacillus,Barnesiella相对丰度明显减少(P<0.05),而Alloprevotella、Parasutterella及Parabacteroides相对丰度显著增加(P<0.05)。补充益生菌后Bacilli纲,Lactobacillales目,Lactobacillaceae科,Lactobacillus属相对丰度明显增加(P<0.05),而Prevotellaceae科,Alloprevotella和Parabacteroides属的相对丰度显著减少(P<0.05)。3、炎症细胞因子测定结果显示,CUMS造模后,血清TNF-α水平以及海马IFN-γ,TNF-α水平显著升高(P<0.05),且CUMS同时补充氟西汀或益生菌后,均可以使血清TNF-α和海马IFN-γ、TNF-α表达降低,具有统计学意义(P<0.05)。4、Western Blotting结果显示CUMS+NS组小鼠海马中IDO1蛋白水平明显高于CON+NS组(P<0.05)。补充益生菌或氟西汀可以显著降低海马中的IDO1蛋白水平(P<0.05)。结论:CUMS小鼠的肠道菌群落结构和组成,外周血促炎细胞因子以及中枢海马促炎细胞因子和IDO1蛋白水平发生了明显的变化。复合菌种益生菌(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)通过对肠道微生态失调的调整作用,抑制外周血TNF-α水平及海马IFN-γ、TNF-α水平,直接或炎症因子介导的抑制海马IDO1表达,具有改善CUMS诱导焦虑和抑郁样行为的作用。肠道微生物-炎症-脑轴可能是复合菌种益生菌(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)抗焦虑抑郁效应的潜在作用机制。