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研究目的:长链非编码RNA（Long noncoding RNA,Lnc RNA）调控生命活动的研究已成为生命科学研究的热点问题之一,Lnc RNA相关研究在生命科学许多领域中发挥着重要作用,如干细胞生物学、发育生物学、神经科学、免疫学和肿瘤学等。然而,特定细胞、组织及疾病模式下Lnc RNA的转录特征及功能尚不明确,目前,仅有少数Lnc RNA的功能被揭示,大量未知Lnc RNA有待进一步发现和鉴定。巨噬细胞是天然免疫的重要组成部分,巨噬细胞自噬体与溶酶体融合及酸化是清除病原体最主要的方式。细胞自噬受多种因素调控,已有的研究表明,Lnc RNA参与了调控巨噬细胞自噬,但其详细的转录组谱式及特异性Lnc RNA调控自噬的分子机制尚不清楚。因此,分析巨噬细胞自噬应激相关的Lnc RNA转录组谱式、筛选调控巨噬细胞自噬的特异性Lnc RNA、研究其分子机制,无论对进一步揭示巨噬细胞自噬的分子机制,还是对认知Lnc RNA在巨噬细胞病原免疫方面的作用和机制,均有重要的理论和应用价值。本课题以巨噬细胞为研究对象,以期揭示在自噬应激条件下,长链非编码RNA的转录组谱式及特异性Lnc RNA分子调控细胞自噬的分子机制。研究方法:（1）构建Rapa和饥饿诱导自噬及3-MA抑制自噬的细胞自噬应激模型,通过转录组测序分析,获得巨噬细胞Lnc RNA转录组谱式;通过功能注释和通路分析,获得自噬相关Lnc RNA;选取显著差异表达的Lnc RNA分子,利用实时荧光定量PCR（RTq PCR）方法予以确证。（2）构建基于第三代慢病毒系统的双色荧光标记的多功能自噬潮检测系统。（3）构建特异性自噬相关Ce RNA作用网络,以明确特异性Lnc RNA Malat1是否调控巨噬细胞自噬。分别在巨噬细胞Raw264.7中采用慢病毒过表达Malat1或Smart Silence技术抑制Malat1表达,通过自噬流慢病毒系统,研究细胞自噬流变化;采用Western Blot检测自噬指标性蛋白（ATG5、P62及LC3 I/II）表达变化。（4）验证Malat1可作为mir-23-3p的Ce RNA调控Lamp1介导细胞自噬。利用RT-q PCR检测Rapa模型中,Malat1-mir-23-3p及Lamp1的表达关系,构建Malat1-3UTR野生型和突变型报告质粒;利用双荧光素酶报告系统验证Malat1与mir-23-3p间的相互作用。通过Smart Silence技术抑制Malat1表达,同时采用mir-23-3p Inhibitor干预,RT-q PCR检测Lamp1 m RNA表达变化、Western Blot检测LAMP1及自噬关键蛋白ATG5、P62及LC3的表达变化,明确Malat1与mir-23-3p间的相互作用及其对Lamp1的表达和细胞自噬的影响。（5）明确Malat1-mir-23-3p-Lamp1调控轴中mir-23-3p是否能够靶向溶酶体膜相关蛋白Lamp1调控细胞自噬。经生物信息学分析,确定Lamp1为mir-23-3p潜在的作用靶标。通过mimics及Inhibitor瞬时转染Raw264.7后,免疫荧光分析内源性LC3,检测自噬体形成状态及数量;激光共聚焦检测自噬流变化;构建Lamp1-3UTR野生型和突变型报告质粒,采用双荧光素酶报告法,确定二者靶向关系。采用mimics或Inhibitor梯度处理检测荧光素酶活性及WB检测靶标Lamp1和自噬关键指标（ATG5、P62及LC3 I/II）,明确mir-23-3p是否靶向Lamp1调控巨噬细胞自噬。研究结果:（1）获得了详细的巨噬细胞Lnc RNA转录谱式。经RNA-SEQ结合生物信息学分析,发现大量Lnc RNA响应自噬应激,经挖掘共得到1127个Lnc RNA,包括831个linc-RNA、129个Intron及152个Antisense-Lnc RNA,发现242条新的Lnc RNA分子。Lnc RNA差异表达238个。Lcn RNA平均编码能力及表达值显著低于编码基因,在染色体上均匀分布,没有偏好性。自噬GO及Pathway注释获得了自噬相关基因83个及104条Lnc RNA分子。通过RT-q PCR分析鉴定了在Rapa诱导自噬下,包括Malat1、AI662270及GAS5等在内的8个Lnc RNA分子表达特性,结果与RNA-SEQ表达趋势一致。（2）成功建立了基于慢病毒的双标记多功能自噬流检测分析技术体系。（3）Malat1可能以Ce RNA机制促进巨噬细胞自噬。自噬Ce RNA网络分析表明,Malat1能够吸附大量mi RNAs。RNAFISH表明Malat1主要分布于巨噬细胞细胞质。过表达Malat1自噬潮分析证明,Malat1能够促进自噬体与溶酶体的融合,促进自噬小体生成。WB实验证明,过表达Malat1能够促进P62降解及LC3 I/II的转换;而Malat1-（si RNA+ASO）则能逆转上述现象。表明,Malat1能促进巨噬细胞自噬。（4）Malat1竞争性吸附mir-23-3p调控细胞自噬。双荧光素酶报告及WES实验表明,Malat1通过结合mir-23-3p影响Lamp1表达而调控巨噬细胞自噬,Malat1能够通过Sponge角色抑制mir-23-3p活性,可能解除其对Lamp1、ATG12、PTEN、AKT1等靶向沉默而增强自噬体与溶酶体的融合,促进晚期自噬发生。（5）Mir-23-3p靶向Lamp1调控巨噬细胞自噬。双荧光素酶报告实验表明,mir-23-3p能够靶向溶酶体膜相关蛋白Lamp1。免疫荧光分析表明,过表达mir-23-3p能够抑制自噬体形成。自噬流分析表明,过表达mir-23-3p显著抑制巨噬细胞自噬。转染mimics和Inhibitor后WB检测自噬标志物表明,mir-23-3p能够调控巨噬细胞自噬。以上研究方法和结论,为今后进一步研究Lnc-Malat1与mir-23-3p及Lamp1互作在巨噬细胞抗病原微生物研究方面奠定了基础。同时,在巨噬细胞中通过计算生物学鉴定获得的大量非编码RNA及建立的研究技术体系,有助于推进巨噬细胞长链非编码RNA的相关研究。