由于生命科学发展的需要,DNA成为分析化学的研究热点,其中DNA测序是现代分析化学的一项重要任务。复杂样品DNA测序的前提是DNA的有效分离。变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据DNA碱基组成对其进行分离的方法,该方法具有高通量、省时且成本较低等优点,是目前普遍应用的一种DNA检测技术。土壤微生物担负着重要的生命系统功能,主要参与有机质分解、养分循环和元素转化等生物学过程,因而在维持和改善土壤质量方面发挥重要作用,这对于缓解粮食、能源、资源和环境等危机具有全球性的重大意义。土壤微生物组成作为土壤系统的基本特征之一,其分析对分析技术提出了极高要求。DGGE技术通过分离PCR扩增的DNA片段检测DNA,结合后续的DNA测序可分析样品中DNA组成,从而通过DNA分析鉴定土壤微生物组成。由于土壤微生物由极其复杂的种群构成,因此,DGGE对DNA片段的高分辨率是DNA测序的关键。本论文建立了 DGGE有效分离土壤微生物16S rRNA基因片段的方法,并应用其分析土壤细菌组成,完成了土壤细菌组成恢复的评价,并首次提出野外条件下盐碱化水平不影响土壤细菌群落组成。同时,本论文也建立了 DGGE有效分离氮循环功能基因的方法,并应用其分析结皮和不同草地使用方式下土壤氮循环微生物组成,首次提出重建植被群落下的结皮土壤微生物主要为Proteobacteria物种,同时,研究发现半干旱草地改为林地对微生物组成影响较小,并能改善土壤质量,而草地改为旱田和水田显著降低了微生物多样性,且导致土壤养分流失。论文详细内容如下:第一章主要介绍了广泛应用的三种微生物组成的检测方法、细菌和氮循环微生物的组成和分布、科尔沁沙地概况以及相关植物群落。重点介绍了变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术的原理、应用、优点和局限。给出了本研究的目的、内容和意义。第二章主要以土壤结皮为实验材料,建立DGGE分离16S rRNA基因片段的方法。采用土壤基因组提取试剂盒从植被为不同年龄的小叶锦鸡儿和28年的山竹岩黄蓍、差巴嘎蒿和小黄柳的土壤结皮中提取微生物总DNA,然后以微生物总DNA为模板,利用细菌和蓝藻16S rRNA特异性引物扩增细菌和蓝藻16S rRNA基因片段。在变性梯度为30%-60%、电压和电泳时间为80 V和9h的条件,细菌16S rRNA基因的PCR产物经DGGE分离出14个DNA片段,即14个条带。这些条带具有较好的重现性,条带清晰,条带与条带之间的距离适于后续的条带切除,因此对所有条带成功进行了DNA测序。DGGE分离蓝藻16S rRNA基因片段的最佳变性梯度与细菌16S rRNA基因片段相同,而电压和电泳时间为60 V和10 h。从蓝藻DGGE图谱上切除和成功测序的DNA片段较少,仅为6个。因此,DGGE分离16S rRNA基因的最佳变性梯度为30%-60%,而电泳条件因基因片段的来源和长度不同而不同。采用构建系统进化树的方法对DNA片段进行了鉴定。结果显示,7个细菌16S rRNA基因片段与Escherichia相关,另外属于Bacillus、Paenibacillus、Shiglla和Pseudomonas的 DNA 片段也被发现。6个蓝藻16S rRNA基因片段属于Microcoleus、Leptolyngbya和Haslea。本研究结果表明,DGGE结合DNA测序可用于分析土壤细菌和蓝藻16S rRNA标记基因组成。第三章主要应用DGGE分离16S rRNA基因的方法,分析了不同植物群落土壤细菌组成,结合土壤物理化学特性和生物活性分析,建立了判断固沙群落土壤细菌组成和养分恢复状况的方法。山竹岩黄蓍、差巴嘎蒿和小叶锦鸡儿是强烈适应风沙环境的代表植物,在中国北部半干旱科尔沁沙地的植被重建中广泛用于固定流动沙丘。土壤样品采自山竹岩黄蓍、差巴嘎蒿和小叶锦鸡儿群落和流沙。在变性梯度为30%-60%、电压和电泳时间为180 V和5 h的条件下,采用DGGE从山竹岩黄蓍、小叶锦鸡儿、差巴嘎蒿和流沙样品中分别分离出21、20、13和17个清晰条带（DNA片段）,且条带间距离适于条带切除。对切除的条带进行了测序,并采用系统进化分析的方法对DNA序列进行了鉴定,结果表明这些DNA序列与Bacteroidetes、Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes 和 Proteobacteria 密切相关,它们是沙地土壤的优势种群。与流沙样品相比,山竹岩黄蓍、小叶锦鸡儿样品分离出更多的条带,表明山竹岩黄蓍、小叶锦鸡儿群落的建立增加了细菌种的数量,而差巴嘎蒿则相反。流动沙丘上山竹岩黄蓍、小叶锦鸡儿和差巴嘎蒿植物群落的建立导致土壤化学和生物活性显著增加。具体而言,土壤有机质、总N、总P、总Mg、有效N、有效P、有效K、电导率、可培养细菌数量、DNA数量和酶活性（脲酶、蛋白酶和磷酸单酯酶）增加。因此,通过在严重退化沙地上种植植被用以恢复微生物学特性和土壤养分是可能的。第四章主要应用DGGE分离16S rRNA基因的方法分析了不同盐碱化水平土壤细菌组成,结合土壤特性、酶活性和群落水平生理图谱（CLPP）分析研究了盐碱化水平对细菌组成、土壤特性、酶活性和代谢图谱的影响。在变性梯度为30%-60%的条件下,三个盐碱水平的草地（分别为0.135%、0.375%和1.063%）土壤样品经DGGE均分离出15个条带（DNA片段）,且三个样品具有相同的16S rRNA基因片段组成,表明盐碱化水平不影响土壤细菌组成。这些条带均被切除并成功测序,DNA片段的系统进化分析结果证实这些DNA片段大多数来源于γ-Proteobacteria,表明γ-Proteobacteria是盐碱化土壤的优势种群。与细菌组成的情况不同,土壤盐含量显著影响土壤特性、酶活性和碳代谢活性。具体而言,随着盐含量的增加,土壤湿度、孔隙率、有机质、全N和P、N和K有效性、DNA含量、微生物量、酶活性（脱氢酶、磷酸单酯酶、脲酶和多酚氧化酶）和碳代谢活性均显著减少;土壤容重、pH和有效P浓度均显著增加。土壤盐含量的增加抑制了土壤细菌增值和代谢活性,但不影响优势细菌群落组成。第五章建立了 DGGE分离土壤结皮固氮（nifH）和反硝化（nosZ）两个功能基因及氨氧化细菌16S rRNA基因片段的方法。另外,基于DGGE的检测结果,采用16S rRNA基因文库技术对结皮中总细菌群落组成进行了分析。土壤结皮样品采自小叶锦鸡儿、山竹岩黄蓍和差巴嘎蒿群落。在变性梯度分别为30%-60%、30%-55%和30%-50%,电压和电泳时间分别为150 V 5 h、60 V 11 h和150 V 3.5 h的条件下,采用DGGE分别从三个样品中分离出11个nifH、13个氨氧化细菌16S rRNA和8个nosZ基因片段,这些片段均进行了测序,表明DGGE对上述基因片段具有较高的分辨率,可用于上述基因片段的检测。随后的DNA片段的系统发育分析表明,三种群落的土壤样品中大多数nifH基因片段与已知的Azotobacter关系密切,氨氧化细菌16S rRNA基因片段由不可培养的Nitrosomonas物种和Nitrosospira cluster 3物种的DNA构成。虽然nosZ基因片段属于Proteobacteria的三个亚类的DNA,几乎一半的DNA片段属于γ-Proteobacteria的Pseudomonas。另外,16S rRNA基因系统发育结果表明,Proteobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes 和 Actinobacteria 是优势类群。DGGE 图谱显示小叶锦鸡儿、山竹岩黄蓍和差巴嘎蒿群落土壤结皮的nifH、氨氧化细菌16S rRNA和反硝化nosZ基因片段组成相似,表明植被类型对氮循环优势菌群组成无显著影响。DGGE结合DNA测序的结果证明Proteobacteria是结皮的优势类群。第六章建立了氨单加氧酶基因amoA和Cu-亚硝酸还原酶基因nirK基因片段的DGGE分离方法,并将其与DGGE分离固氮酶基因nifH、氧化亚氮还原酶基因nosZ和细菌16S rRNA的方法一起用于研究草地使用方式对固氮、氨氧化、反硝化微生物和细菌组成的影响。另外,草地使用方式对土壤特性的影响也进行了分析。土壤样品采自天然草地以及由草地改变而来的林地、旱田和水田。DGGE分离氨氧化细菌和古菌amoA基因片段的最佳变性梯度分别为30%-60%和13%-55%,最佳的电泳条件分别为80 V 10 h和80 V 8h。DGGE分离nirK基因片段的最佳变性梯度和电泳条件分别为15%-60%和150 V 3 h。在上述条件下,DGGE从四个样品中分别分离出18个氨氧化细菌amoA、31个氨氧化古菌amoA和10个nirK的基因片段（清晰的条带）,这些DNA片段均被测序。采用第3章和第5章建立的条件,DGGE对4个样品的细菌16S rRNA、nifH和nosZ基因片段进行了有效分离。对本研究所得的所有DNA片段进行了系统进化分析鉴定,结果表明,草地氮循环微生物群落主要由Proteobacteria的物种构成,其中γ-Proteobacteria是固氮微生物群落的主要成员,属于 β-Proteobacteria、与Nitrosospira cluster 3和Nitrosomonas nitrosa密切相关的种群是氨氧化细菌群落的主要成员,Nitrososphaera构成了氨氧化古菌群落,而反硝化微生物由来自与α-、β-和y-Proteobacteria的物种构成。DGGE图谱显示,草地使用方式的改变对细菌、固氮菌群组成无显著影响。相反地,草地使用方式改变显著影响了氨氧化微生物群落组成。林地、旱田和水田土壤氨氧化细菌种的数量均比草地低,其中旱田减少幅度最大;水田氨氧化古菌种的数量最大,草地、林地和旱田无显著差异。水田和林地与草地之间反硝化群落组成存在差异,旱田与草地差异则不明显。本研究表明,半干旱草地改为旱田和水田对氨氧化微生物群落组成影响显著。另外,土壤特性分析表明,与草地相比,林地土壤有机质、全N、全P和有效P含量显著升高,而旱田和水田除有效P含量高于草地外,上述其他指标均显著降低。另外,旱田土壤电导率显著升高。第七章给出了本论文的结论,通过调整变性梯度、电压和电泳时间可获得最佳分辨率的16S rRNA和氮循环功能基因的DGGE图谱,结合后续的DNA测序,DGGE可用于分析不同类型土壤细菌和氮循环组成;γ-Proteobacteria物种是干旱半干旱科尔沁沙地优势种群;重建植被群落类型和盐碱化程度不影响干旱半干旱土壤细菌组成;流动沙丘上种植适应沙地生长的灌木或半灌木可恢复土壤细菌组成;半干旱草地改为林地对细菌和氮循环微生物组成影响较小,并能改善土壤质量,而草地改为旱田和水田显著降低了氨氧化微生物多样性,且导致土壤养分流失。