论文部分内容阅读
前言长期以来人们一直认为，辐射所致的生物学效应，如基因突变、染色体畸变、细胞死亡和致癌作用等是靶细胞DNA受到损伤后，自身无法修复或错配的结果，这些效应不会出现在未受照射的细胞中。然而越来越多的研究发现，辐射所致的遗传学改变不仅出现在受照靶细胞中，且可发生在或位于靶细胞周围，或与靶细胞的培养液接触的未受照射的正常细胞（旁观者细胞，bystander cells）中，从而使效应明显增强。这种现象称为旁观者效应（bystander effect）。除电离辐射外，其他能造成DNA损伤的不同理化因素亦能诱导旁观者效应：长波紫外线照射的靶细胞也可诱导旁观者效应。研究表明，靶细胞DNA损伤是旁观者效应的起因。细胞在对该损伤进行修复的过程中，或因损伤过重而发生死亡的进程中，能分泌或排泄某些未知的效应物质，即旁观者因子（bystander factor）。这些因子或是直接作用于旁观者细胞，或是向他们传递了诱导效应的信息，从而导致了旁观者效应的发生。短波紫外线（UVC）照射能够使DNA上相邻的两个嘧啶之间形成环丁烷嘧啶二聚体（CPD），CPD能阻止DNA的复制和转录，导致细胞的死亡。UVC作为一种具有较高量子能量的非电离辐射是否能够诱导发生旁观者效应是本实验研究要解决的问题所在。材料与方法1、细胞培养中国仓鼠成纤维细胞V79-C3细胞株于含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃，5％CO2孵箱内培养。2、细胞坏死模型的建立细胞在75ml细胞培养瓶中长到75％融合后，经胰蛋白酶消化，接种至Φ60mm平皿，或其他可供照射之载体，细胞密度根据不同实验需要决定，继续培养。照射前去掉培养液，每皿用PBS冲洗1次，去掉PBS，对照组覆盖一层锡箔。紫外线光源为UVC紫外灯，发射波长为200nm—290nm之间，峰值为254nm，经标准紫外照度计测定辐射强度为9mW／cm2，将平皿置于距光源正下方5mm处垂直照射，设定照射剂量分别为0mJ／cm2，50mJ／cm2，200mJ／cm2，800mJ／cm2，1600mJ／cm2，2000mJ／cm2，照射时间分别为0s，6s，22s，89s，178s，222s。照射后，向平皿中加入完全培养基继续培养，观察靶细胞损伤情况。3、旁观者效应的诱导及诱导效应最强时段去细胞培养液的确定在照射后续的24h内，继续培养受照细胞。以照射结束作为培养计时的起点，在第4，8，12，24h分别吸出培养基过滤后加入正常的细胞中，（并向受照细胞中加入新鲜无血清培养基继续培养），24h后，观察旁观者效应发生的情况。4、指标检测（1）细胞活力：MTT法。（2）细胞增殖能力：克隆集落形成法。（3）坏死／凋亡比率：流式细胞仪法。（4）染色体畸变分析：加入秋水仙素制备中期细胞，收集细胞经低渗、固定、滴片后用Giemsa染液染色后，普通光学显微镜镜检。结果1、V79细胞在50，200，800，1600，2000mJ／cm2不同剂量照射下，以MTT法测定的存活率分别为88.50±5.07％，65.90±3.37％，53.62±4.27％，22.26±2.50％，9.02±1.22％；同样条件下，以克隆集落形成法测定的细胞增殖能力分别为89.28±6.07％，64.14±3.15％，50.69±2.61％，21.72±3.45％，8.64±0.99％；2、该条件下，靶细胞主要以坏死为主，细胞坏死率分别为18.26±1.78％，31.61±2.55％，41.71±3.68％，64.04±2.86％，68.03±6.06％；3、该条件下，靶细胞染色体畸变率分别为2％，6％，15％，24％，30％；4、将V79细胞受2000mJ／cm2剂量的UVC照射后的靶细胞培养液分时段取出，来培养正常细胞，以MTT法测定旁观者细胞的存活率分别为54.91±2.05％，77.03±3.92％，84.73±1.36％，96.70±5.65％；同样条件下，以克隆集落形成法测定的细胞增殖力分别为51.40±3.54％，72.12±2.40％，82.66±2.98％，94.68±4.58％；5、旁观者细胞在不同时段的靶细胞培养液的处理下，主要以凋亡为主，细胞凋亡率分别为：39.49±3.58％，36.86±2.99％，8.80±2.53％，5.32±1.59％；6、旁观者细胞染色体畸变率分别为17％，9％，4％，2％。结论1、本实验研究初步阐明UVC照射导致DNA链损伤后，靶细胞死亡的主要类型为坏死。2、确定它们在死亡进程中能够诱导旁观者效应，并且旁观者细胞死亡的主要类型为凋亡，且凋亡细胞比例随与其共培养的靶细胞培养液取出时段的延后而下降。3、产生旁观者因子最多或活性最强的时段为靶细胞受UVC照射后的最初4小时。