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肠道是仔猪体内重要的营养物质消化、吸收器官,此外也承担着对机体的防御作用,与仔猪的健康状况密切相关。在仔猪断奶时期,仔猪肠道特别容易受到氧化应激的影响。因此减少肠道上皮细胞的氧化应激是提高仔猪健康水平的重要手段。茶树油是一种天然的植物精油,具有抗氧化的功效,已广泛应用于医疗和化妆品等领域,在我们课题组前期的研究中发现,茶树油可提高断奶仔猪抗氧化功能,增强断奶仔猪肠道黏膜免疫功能,降低断奶仔猪的腹泻率。但茶树油是如何提高仔猪抗氧化功能的,其作用机制尚不清楚。本研究拟建立细胞模型,探究茶树油的抗氧化作用机制。试验首先利用H2O2刺激猪回肠上皮IPI-2I细胞建立氧化应激模型,再探究茶树油对猪回肠上皮细胞氧化应激的调节作用,并探索其作用机制。1.猪回肠上皮IPI-2I细胞氧化应激模型的建立细胞氧化应激模型的建立是研究细胞抗氧化机制的基础,因此用较为成熟的H2O2刺激猪回肠上皮细胞IPI-2I建立氧化应激模型。采用不同浓度H2O2刺激IPI-2I不同时间后检测细胞活力,初步筛选刺激浓度和时间之后,再检测IPI-2I细胞内氧自由基(ROS)相对产生量、丙二醛(MDA)含量以及抗氧化酶活力。结果显示,1)随着H2O2刺激时间的增加和浓度的上升,IPI-2I细胞活力显著下降(P<0.05),ROS、MDA产生量相比对照组显著上升(P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)酶活力显著下降(P<0.05)。与对照组相比,200μmol/LH2O2刺激IPI-2I细胞6h,细胞活力显著下降(P<0.05);ROS和MDA含量显著上升(P<0.05);SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px酶活力显著下降(P<0.05)。由此确定采用200μmol/L H2O2刺激IPI-2I细胞6h建立氧化应激模型。2.茶树油对IPI-2I细胞氧化应激的调节作用明确茶树油对猪回肠上皮IPI-2I细胞氧化损伤有缓解作用。应用不同浓度茶树油处理IPI-2I细胞,确定24h内茶树油作用于IPI-2I细胞的安全浓度为0.05%以下。基于前期建立的IPI-2I细胞氧化应激模型,试验分为5组,分别为对照组(CON组,不添加H2O2和茶树油)、氧化应激模型组(H2O2组,添加200 μmol/LH2O2)、H2O2+低浓度茶树油组(HLT组,0.025%TTO+200μmol/LH2O2),H2O2+中浓度茶树油组(HMT组,0.0375%TTO+200μmol/LH2O2)、H2O2+高浓度茶树油组(HHT 组,0.05%TTO+200 μmol/L H2O2)。结果显示,HLT、HMT组细胞活力显著高于H2O2组(P<0.05),ROS相对产生量、MDA含量显著低于 H2O2 组(P<0.05),SOD、T-AOC 和 GSH-Px 含量显著高于 H2O2 组(P<0.05),HLT组细胞中CAT含量显著高于H2O2处理组(P<0.05)。HLT、HMT组细胞Nrf2的表达显著高于H2O2组(P<0.05),HLT处理组细胞Nrf2的表达显著高于HMT组(P<0.05);HLT、HMT、HHT 组CAT表达量显著高于 H2O2 组(P<0.05);HLT、HMT 组细胞 SOD表达显著高于H2O2组(P<0.05)。综上,茶树油能够提高氧化应激下IPI-2I细胞中细胞活力、降低细胞内ROS相对产生量、降低MDA含量、提高抗氧化酶活力以及提高部分抗氧化相关基因的表达量,说明茶树油能够缓解H2O2诱导的IPI-2I细胞氧化应激,其中0.025%TTO浓度效果最佳。3.茶树油对IPI-2I细胞氧化应激的调节作用机制探讨茶树油能够缓解IPI-2I细胞氧化应激损伤,为了更进一步了解其作用机制,于是检测茶树油对猪回肠上皮细胞Nrf2-ARE抗氧化通路的作用。试验分为4组,分别为对照组(CON组,不添加H2O2和茶树油)、氧化应激模型组(H2O2组,添加200 μmol/L H2O2)、茶树油组(TTO 组,0.025%TTO)、低浓度茶树油组(HLT 组,0.025%TTO+200μmol/LH2O2)。结果表明,TTO组肠上皮细胞中Nrf2基因表达显著高于H2O2组和HLT组(P<0.05);HLT组Nrf2表达量显著高于H2O2组(P<0.05);TTO组HO-1和NQO1表达水平显著高于CON组和H2O2组(P<0.05);HLT组HO-1、NQO1、GCLC表达量显著高于H2O2组(P<0.05),而 GCLM表达量显著高于 CON 组(P<0.05)。HLT、TTO 组NQO1、HO-1以及Nrf2的蛋白表达显著高于H2O2组(P<0.05),HLT组NQO1、HO-1以及Nrf2的蛋白表达显著低于CON组(P<0.05)。综上,茶树油能够提高IPI-2I细胞Nrf2-ARE抗氧化通路下游基因HO-1和NQO1表达,能够缓解氧化应激带来的抗氧化基因表达以及蛋白表达下降的问题,从而缓解氧化应激带来的损伤。