抗生素的发现是人类历史的伟大发现之一,其在人类与病原微生物的斗争中发挥了至关重要的作用,但由于近几十年来抗生素的滥用,细菌耐药性问题越来越严重,已成为全球共同面对的一个急需解决的问题。寻找新型抗菌物质来满足临床需求已迫在眉睫。抗菌肽和溶菌酶是近些年研究的比较热的两种抗菌物质,其做为生物体内的初级免疫物质有着很好的抗菌作用,它们都是抗生素的潜在替代品。之前的很多研究主要集中在新的抗菌肽和溶菌酶的发现以及他们的抗菌机理,对其抗菌活性定量研究不够,难以对其开展临床应用研究。本课题对已有文献报道13种抗菌肽,以His6-SUMO为融合蛋白,分别将融合基因克隆至pETDuet载体,在大肠杆菌中原核表达,测定7种能够可溶性表达的抗菌肽的表达量,并开展重组产物对E.coli(ATCC25922)、Bacillus subtilis(ATCC6633)、Salmonella paratyphi(CMCC(B)50094)的最低抑菌浓度分析,发现Thanatin具有最高的表达量和最强的抗菌效果,其余抗菌肽的表达量均偏低,抗菌效果显著低于Thanatin。根据抗菌肽的抗菌机理,分别在Thanatin的N端和C端增加精氨酸和天冬氨酸残基其目的以提高其抗菌活性,但结果显示这些插入突变对其抗菌活性没有提高,反而随着两端氨基酸数目的增加活性下降。随后对Thanatin部分氨基酸残基进行置换突变分析,探究特定氨基酸残基与其活性的关系。结果揭示其N端的第六位缬氨酸、第八位异亮氨酸和第九位异亮氨酸这三个疏水性氨基酸的突变均能使其抗菌活性有很大的下降,其他一些氨基酸的突变对活性影响不明显。分别用6种不同的溶菌酶基因,与抗菌肽Thanatin、Moricin、Came基因进行串联融合,再同样以His6-SUMO为融合蛋白,pETDuet为载体,在大肠杆菌中表达。6种溶菌酶中只有T4L和ST4L能够表达,18种抗菌肽-溶菌酶串联体中只有Thanatin-T4L、Thanatin-ST4L能够可溶性表达。通过对它们的最低抑菌浓度的测定,T4L和ST4L对革兰氏阳性菌Bacillus subtilis(ATCC6633)有非常优异的杀菌效果,但Thanatin-T4L和Thanatin-ST4L串联体的针对革兰氏阴性菌的抗菌活性则相对单独抗菌肽Thanatin有很大下降,针对革兰氏阳性菌的抗菌活性相对单独溶菌酶有微弱下降。根据溶菌酶的单独表达情况设计11种T4L-AMPs,但只有6种能够在大肠杆菌中可溶性表达,对最低抑菌浓度的测定发现,T4L-AMPs串联体针对革兰氏阳性菌的抗菌活性比T4L的活性有很大的减弱,并且对革兰氏阴性菌的抗菌活性也没有明显的提升。我们再次根据单独抗菌肽的表达及活性,设计5种Thanatin-AMPs串联体,经表达及活性测定,发现串联体的活性相对单独Thanatin的抗菌活性有不同程度的下降。同时我们测定抗菌肽Thanatin中两个半胱氨酸氨酸形成的二硫键对抗菌活性的影响。通过对含有二硫键及不含二硫键Thanatin最低抑菌浓度的测定,发现二硫键的形成会导致其抗菌活性微弱的下降。然后我们对含有二硫键及不含二硫键的合成的多肽Thanatin进行结晶尝试,期望得到Thanatin晶体,以能够从结构上阐释其抗菌机理。最终通过众多结晶Buffer的筛选和2周的培养,没有得到晶体。最后我们对抗菌肽Thanatin和T4溶菌酶产业化研究进行摸索。先试图用枯草芽孢杆菌表达系统对二者进行表达的尝试,分别利用胞内表达载体pHT01和胞外表达载体pHT43和His6-SUMO标签进行融合表达,用电击转化经小量表达后,经检测这两种抗菌物质均没有表达。为了大量获得重组Thanatin我们在大肠杆菌宿主中进行大规模发酵的摸索,发酵体积达到1.5吨,成功表达出His6-SUMO-Thanatin蛋白,并得到7.84 Kg的湿菌体。