阻塞性睡眠呼吸暂停综合症（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）主要表现为睡眠时打鼾并伴有呼吸暂停和睡眠浅表，夜间反复发生低氧血症和睡眠结构紊乱。OSAS病人引起的长期的动脉血氧饱和度波动，造成慢性间歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH），对身体多个系统产生严重影响。国外资料显示，成年人中OSAS的患病率高达5%-20%。大量研究数据表明OSAS是除年龄、性别、酗酒、精神紧张以及心、肾疾病外的高血压病独立危险因素，但其导致高血压的确切发生、发展机制尚未阐明。内皮素-1（endothelin-1，ET-1）是一种具有收缩血管和促进平滑肌细胞增殖作用的活性多肽。OSAS患者睡眠时呼吸暂停后的用力吸气可导致胸腔负压升高，静脉回流增多，管腔剪切力增加，导致血管内皮受损。同时CIH也可直接损伤内皮细胞，导致内皮功能紊乱，ET-1合成增加而降解减少，引起ET-1水平升高。众多研究显示OSAS患者血压增高与ET-1水平升高相关。OSAS患者伴有肌肉交感神经活动增强，血浆儿茶酚胺浓度增加。目前有证据表明，CIH引起的动脉血压升高至少部分是由于增加了化学反射的敏感性，进而增加交感神经活动，尽管引起动脉血压升高的机制不十分清楚，作为主要感受动脉血氧变化的化学感受器，颈动脉体，被证明介导CIH引起的交感神经活动和动脉血压的增加。如果预先切除颈动脉体或肾交感神经则可防止CIH诱导的动脉血压升高。研究表明，间歇性低氧可通过改变颈动脉体内的神经调质而增加外周化学感受器的敏感性。大量研究数据提示ET-1增加颈动脉体化学敏感性，同时改变颈动脉体内ETA和ETB受体表达。目前有关ET-1在血压调节及在高血压发病中的作用机制尚未完全阐明，本研究利用模拟OSAS的大鼠CIH模型在整体动物和离体器官水平，采用电生理学和分子生物学等方法探讨了：⑴ET-1受体拮抗剂对CIH所致高血压大鼠血流动力学及心肌组织形态学的影响；⑵ET-1对CIH大鼠颈动脉窦神经放电的影响及其分子机制；⑶CIH对大鼠主动脉ET-1受体表达及血管内皮功能的影响。第一部分ET-1受体拮抗剂对慢性间歇性低氧所致高血压大鼠血流动力学及心肌组织形态学的影响目的：探讨内皮素受体拮抗剂对慢性间歇性低氧所致高血压大鼠的降压作用。方法：健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重190-210g，购于河北医科大学实验动物中心。将80只大鼠随机分为6组：常氧对照组（Normoxia）和间歇性低氧组（CIH）各24只，间歇性低氧+BQ123组（CIH+BQ123）、间歇性低氧+BQ788组（CIH+BQ788）、间歇性低氧+BQ123+BQ788组（CIH+BQ123+BQ788）和间歇性低氧+DMSO组（CIH+DMSO）各8只。喂养期间动物自由进食、饮水。参照文献建立间歇性低氧动物模型。间歇性低氧舱采用自动气压调控，程序设计每一低氧复氧循环时间为2min，前1min充N₂使氧浓度降至9%，后一分钟充O₂使氧浓度恢复到21%。除对照组大鼠置放于正常的舱内予以空气供气外，其余5组大鼠在每日8时至16时放入间歇性低氧舱中，共21天。常氧对照组和CIH组各选8只和其他4组大鼠各8只，在第一日上舱前2小时尾静脉注射给予不同处理因素。其中对照组、CIH组分别注射生理盐水（5ml/kg）；CIH+BQ123组注射BQ123（将BQ123用生理盐水按10μg/ml稀释，每次给予50μg/kg）；CIH+BQ788组注射BQ788（将BQ788先用DMSO初溶，再用生理盐水按10μg/ml稀释，每次给予50μg/kg，其中DMSO终浓度＜0.05%）；CIH+BQ123+BQ788组（分别将BQ123和BQ788按上述方法稀释为20μg/ml后混匀，每次给予50μg/kg）；CIH+DMSO组注射DMSO（与BQ788组DMSO注射浓度相同）。以后每隔2天按上述方法重复注射一次。分别检测下列指标：⑴重量检测：包括体重（body weight，BW）、心脏重量指数（heart weight index，HWI）、左心室重量指数（1eft ventricularweight index，LVWI）；⑵血液生化指标：血浆ET-1、NO含量测定；⑶大鼠尾动脉收缩压，每隔2天测量一次；⑷血流动力学检测：颈动脉收缩压（systolic arterial pressure，SAP）、颈动脉舒张压（diastolic arterialpressure，DAP）及颈动脉平均动脉压（mean arterial pressure，MAP），心率（heart rate，HR）、左室收缩内压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）和左室最大收缩和舒张速率（maximum ascending and descending rate of ventricularpressure，±dp/dtmax）。完成上述血流动力学检测后，对照组及CIH组大鼠继续股静脉插管给以ET-1（0.03nmol/kg），读取LVSP最大值，待LVSP恢复至药前水平10min后两组分别给以内皮素受体拮抗剂（endothelinreceptor antagonists， ETRA） BQ1230.3mg/kg， BQ7880.3mg/kg，BQ123+BQ788各0.3mg/kg，20min后再次给以ET-1（0.03nmol/kg），记录LVSP最大值，计算给予ETRA前后内皮素诱导收缩的LVSP变化率。⑸组织学检测：HE染色观察心肌组织的病理学变化。结果：1ETRA对CIH大鼠体重及HWI、LVWI的影响与常氧对照组比较，CIH组大鼠体重明显降低（P <0.05）；与CIH组比较，各给药组大鼠体重未见差异。各组大鼠间HWI和LVWI亦未见差异。2ETRA对CIH大鼠血浆ET-1、血清NO含量的影响与常氧对照组比较，CIH组大鼠血浆ET-1含量显著升高，血清NO含量显著降低（P <0.01）；与CIH组比较，各给药组大鼠血浆ET-1含量未见差异，CIH+BQ788组大鼠血清NO含量显著降低（P <0.01）。3ETRA对CIH大鼠尾动脉压的影响与常氧对照组比较，CIH组大鼠在造模第15后尾动脉压明显升高（P<0.05或P <0.01）；与CIH组比较，CIH+BQ123组与CIH+BQ123+BQ788组大鼠在造模第12天后尾动脉压均明显降低（P <0.05或P <0.01），其余各组未见差异。4ETRA对CIH大鼠颈动脉压的影响与常氧对照组比较，CIH组大鼠颈动脉SAP、DAP和MAP均明显升高（P <0.01）；与CIH组比较，CIH+BQ123组与CIH+BQ123+BQ788组大鼠SAP、DAP和MAP均明显降低（P <0.01），其余各组未见差异。5ETRA对CIH大鼠血流动力学的影响与对照组比较，CIH组大鼠LVSP、±dp/dtmax均显著升高；与CIH组比较，CIH+BQ123组与CIH+BQ123+BQ788组大鼠LVSP、±dp/dtmax均明显降低（P <0.01），其余各组无显著差异。6ET-1和ETRA对CIH大鼠LVSP的影响完成上述血流动力学检测后，常氧对照组和CIH组继续股静脉注射给药观察LVSP变化情况。股静脉注射ET-1后常氧对照组和CIH组大鼠LVSP均显著升高（P <0.05），其中CIH组大鼠LVSP变化率明显高于常氧对照组（P <0.01）；经BQ123单独或联合BQ788干预后再次注射ET-1，两组大鼠LVSP均显著降低（P <0.05），与常氧对照组比较，CIH大鼠LVSP变化率明显升高（P <0.01）；而经BQ788干预后再次注射ET-1，常氧对照组大鼠LVSP显著升高（P <0.05），CIH组大鼠LVSP未见明显变化，与常氧对照组比较，CIH组大鼠LVSP变化率明显降低（P <0.01）。7ETRA对CIH大鼠左心室组织形态学的影响CIH组与DMSO组大鼠心肌组织病变程度相似，主要表现为心肌细胞萎缩，部分心肌细胞点状坏死，部分内皮细胞坏死脱落。CIH+BQ123组与CIH+BQ123+BQ788组大鼠主要表现为部分心肌细胞萎缩，少量内皮细胞坏死脱落。与CIH组相比，病变程度明显减轻。CIH+BQ788组大鼠主要表现为心肌细胞明显萎缩，片状坏死伴纤维化，与CIH组相比明显加重。结论： ET_A受体拮抗剂BQ123以及ET_A受体拮抗剂BQ123和ET_B受体拮抗剂BQ788联合应用均可降低CIH所致高血压，有效调节血流动力学各项指标，对CIH所致心肌损伤具有一定的保护作用。第二部分ET-1对慢性间歇性低氧大鼠颈动脉窦神经放电的影响及其分子机制目的：观察ETRA及相关信号通路拮抗剂对ET-1诱发CIH大鼠CSN放电增强的影响以探讨ET-1作用于颈动脉体的分子机制。方法：清洁级雄性SD大鼠，体重190-210g，购自河北医科大学动物中心，随机分成2组：常氧对照组和CIH组。饲养方法及CIH造模方法同第一部分。分别检测下列指标：⑴采用隔离灌流技术，观察给予不同处理因素后颈动脉窦神经放电的变化情况。给予不同浓度ET-1（50，100，200，400pmol/L）灌流，观察颈动脉窦神经放电的剂量反应曲线；给予ET-1（200pmol/L）灌流后，记录颈动脉窦神经放电最大值，待基线降至平稳后，分别给予ET_A受体拮抗剂BQ123（10μmol/L），ET_B受体拮抗剂BQ788（10μmol/L），选择性L-型钙离子通道拮抗剂硝苯地平（10μmol/L），PLC拮抗剂U73122（10μmol/L），PKC拮抗剂Chelerythine chloride（10μmol/L），p38MAPK拮抗剂SB203580（10μmol/L）以及CaMKⅡ拮抗剂KN-62（10μmol/L）干预15分钟后，再次给予ET-1（200pmol/L）灌流，记录颈动脉窦神经放电最大值。⑵采用Western blotting技术，在间歇性低氧后不同时间（15min，1h，3h，5h，8h，2w2h and3w）分别取常氧对照组及CIH组大鼠颈动脉体测定ET_A，ET_B，p38MAPK，phospho-p38MAPK，phospho-CaMKII和phosphor-PKC的蛋白表达。结果：1CIH对CSN放电的影响与常氧对照组比较，CIH组大鼠CSN放电明显增强（P <0.01）。2ET-1对CIH大鼠CSN放电的影响与常氧对照组比较，剂量反应曲线显示CIH组大鼠对不同剂量ET-1诱导CSN放电均明显增强（P <0.05或P <0.01）。3CIH对颈动脉体ET_A和ET_B蛋白表达的影响与常氧对照组比较，CIH后颈动脉体ET_A和ET_B蛋白表达均明显增多（P <0.01）。4ETRA对ET-1诱导CSN放电增强的影响在两组中，选择性ET_A受体拮抗剂BQ123均可阻断ET-1诱发的CSN放电增强（P <0.01），然而选择性ET_B受体拮抗剂BQ788对ET-1诱发的CSN放电增强则无影响。3CIH不同时间点对大鼠颈动脉体p38MAPK，p-p38MAPK，PKC以及CaMKⅡ蛋白表达的影响与常氧对照组比较，在CIH后3w颈动脉体中p38MAPK蛋白表达明显增多，p-p38MAPK蛋白表达在各个时间点均明显增多，p-PKC蛋白表达在1h，3h，8h，2w2h，3w后增多，p-CaMKⅡ蛋白表达在1h，8h，2w2h，3w后增多（P <0.01或P <0.05）。4部分信号通路拮抗剂对ET-1诱导CIH大鼠CSN放电的影响应用选择性L-型钙离子通道阻断剂硝苯地平，PLC拮抗剂U73122，PKC拮抗剂Chelerythine chloride，p38MAPK拮抗剂SB203580以及无钙灌流液均能降低ET-1诱导的CSN放电增强，CIH组大鼠较常氧对照组大鼠更为显著（P <0.01）；选择性CaMKⅡ拮抗剂KN-62能增加ET-1诱导的CSNA增强（P <0.01）。结论：CIH可诱发大鼠CSN放电增强，可能与CIH使颈动脉体ET_A受体上调，对ET-1的敏感性加强有关；ET-1使CIH大鼠颈动脉窦神经放电增强可能与激活PLC/PKC/p38MAPK信号通路、L-型钙离子通道及CaMKII有关。第三部分慢性间歇性低氧对大鼠主动脉ET-1受体表达及血管内皮功能的影响目的：探讨CIH对大鼠主动脉ET-1受体表达及血管内皮功能的影响。方法：清洁级雄性SD大鼠，体重190-210g，购自河北医科大学动物中心，随机分成2组：常氧对照组和CIH组。饲养方法及CIH造模方法同第一部分。造模结束后分别取各组大鼠主动脉进行检测。⑴采用离体血管灌流技术，观察乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）对苯肾上腺素（phenylephrine，PE）预收缩产生的舒张效应的影响；观察外源性ET-1对各组主动脉环张力的影响，以及选择性ET_A受体阻断剂BQ123，选择性ET_B受体阻断剂BQ788和NOS抑制剂L-NAME对ET-1诱导主动脉环张力的影响。⑵HE染色观察主动脉的组织病理学变化。⑶RT-PCR测定ET-1，ET_A和ET_B受体mRNA的表达。⑷免疫组织化学法观察ET-1、ET_A受体和ET_B受体的表达分布。⑸Western Blotting测定eNOS蛋白的表达。⑹酶转化法测定主动脉组织中NO的含量。结果：1CIH对ET-1诱导主动脉环收缩的影响大鼠主动脉对ET-1诱导的收缩呈剂量依赖性增强，与常氧内皮完整主动脉环相比，常氧去除内皮和CIH均能使主动脉对ET-1的敏感性增强（P <0.01），但与CIH大鼠相比，常氧去内皮组主动脉环对ET-1诱导的收缩反应更为敏感（P <0.01）。2CIH对主动脉内皮依赖性舒张功能的影响在CIH组ACh对PE预收缩产生的舒张效应明显低于常氧内皮完整组（P <0.01），明显高于常氧去内皮组（P <0.01）。3ET-1受体阻断剂对ET-1诱导主动脉环收缩的影响对于不同组的大鼠主动脉环，BQ123几乎均能完全阻断ET-1诱导的主动脉收缩。BQ788部分抑制ET-1诱导的收缩，在CIH组，BQ788对ET-1诱导收缩的抑制作用明显高于常氧内皮完整组（P <0.01），但显著低于去内皮组（P <0.01）。4NOS抑制剂L-NAME对ET-1诱导主动脉环收缩的影响在常氧内皮完整的情况下，L-NAME可显著加强ET-1诱导的收缩（P<0.01），常氧去除内皮和间歇性低氧后，L-NAME对ET-1诱导的收缩均无影响，内皮完整组比较有显著性差异（P <0.01）。5CIH对主动脉结构的影响HE染色观察常氧大鼠主动脉，内皮层完整，内皮细胞排列规则；经过CIH处理后的大鼠主动脉，内皮细胞胞浆萎缩，局部细胞脱落。6CIH对大鼠主动脉ET-1、ET_A受体和ET_B受体mRNA表达及蛋白表达的影响与常氧大鼠相比，CIH大鼠主动脉ET-1和ET_A受体mRNA表达显著升高（P <0.01），ET_B受体mRNA表达却明显降低（P <0.01）。免疫组织化学分析其蛋白定位发现，CIH处理后，大鼠主动脉内皮层和平滑肌层均有ET-1表达的增多，ET_A受体主要集中在平滑肌层表达，并且CIH使血管平滑肌层ET_A受体表达增多，ET_B受体在平滑肌层和内皮层均有分布，并且CIH后，ET_B受体在平滑肌和内皮层的表达均有减少。7CIH对大鼠主动脉组织NO含量及eNOS表达的影响与常氧大鼠相比，CIH大鼠主动脉组织NO的含量明显降低（P <0.01），并且eNOS蛋白表达也显著降低（P <0.01）。结论：ET-1导致CIH大鼠主动脉收缩性加强主要与CIH诱发主动脉平滑肌ET_A受体上调有关，另外CIH导致主动脉内皮损伤，内皮细胞ET_B受体表达减少，内皮依赖性血管舒张功能降低也是其中一个重要因素。