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鸡杆菌(Gallibacterium)属于巴氏杆菌科新成立的一个属,包括输卵管炎放线杆菌(A.salpingitidis)、鸭巴氏杆菌(Pasteurella anatis)、鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)和禽类溶血性巴氏杆菌(Avian P.haemolytica-like),而鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)则为代表种,属于革兰氏性阴菌。研究发现鸭源鸡杆菌属于条件致病菌,不但是构成鸡上呼吸道及下生殖道正常菌群的一部分,而且在一定条件下引起蛋鸡腹膜炎、输卵管炎等生殖道疾病和呼吸道等疾病,造成产蛋量和产蛋质量下降、死亡率上升。G.anatis存在多重耐药及抗原多样性,导致抗生素的防治效果越来越不理想,从而给养殖业造成巨大的经济损失。目前对于G.anatis的治病机理的研究和疫苗的研发十分有限,仅有几个预测到的毒力因子得到认证,但是其致病机制仍未被阐明。本试验首次针对G.anatis外膜蛋白A(Omp A)进行初步探究,借助PCR和生物信息学方法,成功得到omp A基因,并对其在G.anatis中的分布状态做了了解,对可能存在的抗原表位进行了预测,用重组外膜蛋白A制备了兔源多克隆抗体,从而对其免疫原性进行了研究,通过将重组蛋白制备疫苗免疫小鼠,对其免疫保护性有了了解。为了进一步了解omp A基因功能,本试验利用靶向基因操作技术尝试对omp A基因进行缺失。1、鸭源鸡杆菌外膜蛋白A基因克隆与功能分析参照Gen Bank上公布的UMN179的omp A核苷酸序列,设计一对特异性引物用以扩增并克隆omp A全基因序列。对扩增出的G.anatis omp A基因,通过生物信息学相关软件对Omp A的氨基酸序列进行分析,预测其结构特征及可能存在的B细胞抗原表位。结果显示23株G.anatis均存在omp A基因,并且高度保守;其三级结构预测分析显示Omp A为β桶状孔道结构,由10个反向平行β折叠片构成;不同的G.anatis之间存在相同的B细胞抗原表位,表明不同菌株之间可能存在交叉免疫原性。本试验为进一步研究G.anatis omp A基因功能奠定了基础,也为G.anatis诊断方法的建立及疫苗的研制提供能参考依据。2、鸭源鸡杆菌外膜蛋白A基因的原核表达、抗原性及免疫原性鉴定设计特异性引物扩增G.anatis的去信号肽omp A基因,连接到原核表达载体p ET32a(+),成功构建了原核表达载体p ET32a(+)-Omp A,并且在BL21大肠杆菌中得到了表达;SDS-PAGE分析显示,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;Western blotting结果显示重组蛋白能够与G.anatis阳性血清发生特异性结合,而不同菌株也能够与兔源Omp A多抗血清发生特异性结合,这表明Omp A具有良好的免疫原性和反应原性,具有成为具有交叉免疫保护性疫苗的潜能。3、鸭源鸡杆菌重组外膜蛋白A的免疫保护性研究将纯化的重组蛋白r Omp A和灭活全菌分别制成疫苗免疫小鼠,同时设立PBS对照组。共免疫三次,每次免疫间隔两周,每次免疫后7 d小鼠断尾采血并分离血清,通过ELISA检测抗体效价。三免后14 d进行攻毒,结果表明:r Omp A组和全菌灭活苗组抗体水平明显高于对照组;r Omp A组和全菌灭活苗组存活率达到50%与80%,而PBS对照组小鼠全部死亡。这些均表明Omp A能够诱导小鼠产生保护性抗体,为进一步研究G.anatis Omp A功能进而防治鸡输卵管炎、腹膜炎等疾病奠定基础。4、鸭源鸡杆菌omp A基因缺失突变株的构建根据Gen Bank上公布的UMN179全基因序列,设计特异性引物,扩增omp A基因上下游同源臂,选择卡那抗性盒子作为筛选标记,以G.anatis YU-PDS-RZ-1-SLG株基因组为模板扩增omp A基因上下游同源臂,克隆至p MD18-T载体中构建重组质粒p MD18-U-D,随后将卡那抗性基因插入到上下游同源臂之间,构建同源重组载体p MD18-U-K-D,利用PCR方法扩增转化片段U-K-D,通过自然转化法转入到G.anatis感受态细胞,目前已经取得突破性进展。