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对猪卵母细胞体外受精(IVF)和孤雌激活(PA)的研究,有助于揭示卵母细胞活化机制和受精机理,为优化早期胚胎体外生产系统提供理论依据。体外成熟42-46h的猪卵母细胞,与最终浓度为1×106个/ml的精液共孵育6h,或用Ionomycin(5min)+6-DMAP(4h)联合激活,最后在胚胎培养液NCSU-23中进行体外培养,48h后检查卵裂率,第168h记录囊胚发育情况。结果发现:
1)本研究选用的TL-Hepes液、DPBS液、TCM-199(Ⅰ)液和TCM-199(Ⅱ)液作为洗卯液,猪卵母细胞在体外成熟培养42-46h后的核成熟率分别为:57.35%、58.11%、58.11%和57.81%,体外受精后第48小时卵裂率分别为:70.82%、71.35%、74.92%和73.79%,第168小时囊胚率分别为:5.16%、4.62%、4.85%和5.02%,核成熟率之间、卵裂率之间、囊胚率之间均无显著差异(P>0.05)。说明四种洗卵液均可用于猪卵母细胞的洗涤,但从配制及价格上考虑,DPBS液是最佳选择。
2)成熟液中添加8.巯基乙醇(10、50μmol/L)对猪卵母细胞IVF或PA后胚胎体外发育没有明显的促进作用,当浓度达到250μ/mol/L时卵裂率和囊胚率明显下降[0、10、50μmol/L组和250μmol/L组经IVF后卵裂率分别为:59%、59.55%、61.06%vs.50.86%,p<0.05;囊胚率分别为:5.86%、6.36%、6.19%vs.3.02%,p<0.05。经PA后卵裂率分别为:79.43%、79.25%、78.13%vs.66.35%,p<0.05;囊胚率分别为:19.62%、20.28%、18.30%vs.9.62%;p<0.05]。
3)受精液中添加B.巯基乙醇(2、10、5μmol/L)对猪卵母细胞IVF后的早期胚胎发育没有明显的促进作用,当浓度达到250μmol/L时卵裂率和囊胚率明显下降[0、2、10、5μmol/L组和250μmol/L组的卵裂率分别为:78.26%、75.68%、77.88%、74.11%VS.55.08%,p<0.05;囊胚率分别为:6.01%、6.38、6.49%、5.65%vs.1.71%,p<0.05]。
4)受精液中添加BSA(0.1-0.8%BSA)对猪卵母细胞IVF后胚胎体外发育可能具有促进作用(各试验组与对照组的囊胚率分别为:1.76%、3.20%、3.60%、3.52%vs.0.40%;p=0.07),但其效果有待进一步验证。
5)在受精液中添加咖啡因(1、2、4mM)对猪卵母细胞的IVF及早期发育与对照组相比没有明显提高的效果[各试验组与对照组的囊胚率分别为:1.51%、1.81%、1.52%vs.2.45%;p>0.05]。
6)无极体卵母细胞经IVF或PA后也可以发育至囊胚阶段,但发育能力比有极体的卵母细胞差[经IVF后卵裂率分别为:55.40%vs.62.19%,p>0.05;囊胚率分别为:2.33%vs.4.87%,p<0.05。经PA后卵裂率分别为:64.81%vs.75.45%,p<0.05;囊胚率分别为:12.96%vs.24.54%:p<0.05]。