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γ-亚麻酸(GLA;C18:3-△6,9,12)是一种人体必需脂肪酸,是具有重要生理活性物质前列腺素、花生四烯酸和白三烯的前体,在人体的激素调节以及脂肪酸代谢过程中有着重要的生理作用。γ-亚麻酸资源稀少而又具有独特的生理功能,因此其合成过程中的关键酶△6-脂肪酸脱氢酶成为国内外学者研究的热点。
本课题在卷枝毛霉M29的△6-脂肪酸脱氢酶基因于酵母中进行功能验证的基础上,探索建立该基因在大肠杆菌及烟草等模式生物中的表达体系。旨在通过基因工程技术,构建原核表达载体进而获得高产γ-亚麻酸的大肠杆菌工程菌株;构建植物表达载体,探索利用植物基因工程改良油料作物品质的可行性。
(1)△6-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中表达:用限制性内切酶XhoI单酶切原核表达载体pGEX-4T-1和中间载体pBK-CMV-DES6XS,分别回收大载体片段和目的基因片段,将回收纯化的酶切产物在T4-DNA连接酶的作用下进行连接,从转化的大肠杆菌DH5α中筛选含有目的基因并且正确插入的重组质粒pGEX-4T-1-△6。将重组质粒转化到原核表达宿主菌BL21中,在适宜的培养基及培养条件下进行蛋白诱导表达,△6-脂肪酸脱氢酶大小为52.4kD,加上GST标签之后目的蛋白的大小为78.4kD。经Westernblot分析鉴定,卷枝毛霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中有微量表达,说明在原核系统中表达该基因是可行的。
(2)△6-脂肪酸脱氢酶基因在烟草中表达:利用已经携带△6-脂肪酸脱氢酶基因的组成型植物表达载体pCAMBIA1301+121+DES6和种子特异性植物表达载体pCAMBIA1301+121+SDES6,通过农杆菌介导法转化烟草三生烟。通过对抗性烟草进行PCR检测,获得21株携带△6-脂肪酸脱氢酶基因的阳性植株,其中17株含种子特异性启动子,4株含组成型启动子。
后续试验主要对烟草种子的脂肪酸成分进行气相色谱分析,以期获得△6-脂肪酸脱氢酶基因在植物中表达的更多信息,为今后油料作物的转基因改造提供理论依据。