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猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)是无囊膜单链线状DNA博卡病毒属成员。自2009年在瑞典患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪体内被检测出后,在世界范围内广泛流行,多个病毒种或基因型被发现,依据系统进化关系可分为G1,G2,G3三个PBoV基因群组。这一新发猪病毒引起了各国的普遍关注,但人们对其研究仍处于初级的探索阶段,PBoV的检测和分型方法并不全面。因此发展有效和可靠的检测技术对PBoV流行病学调查分析非常重要。在本研究中,分别构建了PBoV普通多重PCR和EvaGreen多重实时荧光PCR检测方法并应用于临床样品检测。本研究中,在对三个基因群组基因组序列进行同源性分析的基础上,分别设计特异性引物,首先构建了一个普通多重PCR方法用于同时检测和鉴定不同分型的PBoV。此方法可特异地检测三个PBoV基因群组,对PBoV G1,PBoV G2和PBoV G3检测灵敏度分别为1.0×103,4.5×103和3.8×103 copies/μL,与三个PBoV基因群组普通单重PCR的灵敏度1.0×103 copies/μL相近。利用新建立的多重PCR检测方法来检测227个临床样品。PBoV G1,PBoV G2和PBoV G3检测阳性率分别为1.3%,2.6%和12.3%。其中三个基因群组检测有混合感染,PBoV G1与PBoV G3、PBoV G2与PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2与PBoV G3混合感染检出率分别为0.4%、0.9%和0.4%。除在猪粪样品中多检测出一个PBoV G2阳性外,PBoV基因群组单重PCR结果与多重PCR结果相同。建立的基于EvaGreen PBoV单重或多重实时荧光PCR扩增后经熔解曲线分析,三个基因群组的扩增产物均形成特异熔解峰,PBoV G1、PBoV G2和PBoV G3的Tm值分别为81.3±0.34°C,78.2±0.37°C和85.0±0.29°C,各病毒间Tm值间隔在3°C左右,而非靶标病毒及空白阴性对照无特异熔解峰产生,通过Tm差异可区分鉴定三个PBoV基因群组,表明建立的方法具有良好的特异性。三个基因群组EvaGreen单重实时荧光PCR检测灵敏度分别为25 copies/μL(PBoV G1),10 copies/μL(PBoV G2)和25 copies/μL(PBoV G3);而EvaGreen多重实时荧光PCR体系下单个基因群组的检测灵敏度稍有下降,依次为100 copies/μL(PBoV G1)、50 copies/μL(PBoV G2)和100 copies/μL(PBoV G3);三个基因群组同时存在时EvaGreen多重实时荧光PCR检测灵敏度依次为250 copies/μL(PBoV G1),250 copies/μL(PBoV G2)和100 copies/μL(PBoV G3)。EvaGreen单重实时荧光PCR和EvaGreen多重实时荧光PCR的重复性试验变异系数都小于5%,具有较好的重复性。EvaGreen多重实时荧光PCR对227个样品检测结果为:PBoV G1阳性率为15.0%,PBoV G2的阳性率为25.1%,PBoV G3的阳性率为41.9%,与利用EvaGreen单重实时荧光PCR检测的17.2%PBoV G1,29.1%PBoV G2和44.5%PBoV G3阳性率结果较为一致;其中,PBoV G1与PBoV G2、PBoV G1与PBoV、G3 PBoV G2与PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2与PBoV G3混合感染检出率分别为3.1%、5.7%、13.2%及3.1%。上述结果表明PBoV在国内猪群中较流行。对PBoV检测阳性的样品进行克隆测序,并将测得的目的片段序列分别与PBoV全基因组序列或者接近全基因组序列间的核苷酸序列进行基因序列比对、同源性和系统进化树分析。结果显示三组PBoV基因群组内的同源性比较高,范围在72.1-100%之间,而基因群组间的核苷酸序列同源性较低为3.2-54.2%,表明将本研究构建的普通多重PCR和EvaGreen多重实时荧光PCR两组PBoV检测方法选择的诊断区区分PBoV G1、PBoV G2与PBoV G3三个基因群组的基因分型方法可行且具有代表性,同时证实猪群中PBoV具有较高的遗传多样性。本研究成功构建立了普通多重PCR和Eva Green多重实时荧光PCR两组PBoV检测和分型方法,可以满足不同调查和研究的检测需求,这两组多重PCR检测方法能最大限度地节约检测时间,提高工作效率,适合养猪场大批量检测需求,为PBoV的流行病学调查研究和临床检测提供了良好的检测技术手段。