目的:脓毒症是由感染引起的机体炎症反应失调,前期表现为过度的炎症反应,而后发生免疫细胞凋亡、免疫紊乱和免疫抑制,免疫功能异常可能是严重脓毒症或感染性休克患者死亡的主要原因。巨噬细胞作为一种先天性免疫细胞,在脓毒症的发生发展中起到了重要作用。脂多糖是一种存在于革兰氏阴性菌的外膜中的物质,通常用于模拟炎症反应。线粒体作为所有真核细胞的能量工厂,为细胞的各项生命活动提供必须的能量,脓毒症引起的多器官功能障碍可能与线粒体功能障碍相关。线粒体自噬是一种特异性自噬,通过清除受损或功能失调的线粒体对线粒体网络系统进行质量控制,从而在细胞应对各种刺激时,减少线粒体炎症和凋亡信号的释放,减轻炎症反应,抑制细胞凋亡。右美托咪定是临床麻醉工作和ICU中常用的镇静药物,临床科研及基础研究发现其存在抗炎、抗凋亡和器官保护作用,但是其作用机制不明。本研究拟探讨右美托咪定对线粒体自噬、炎症反应和细胞凋亡的影响,阐述其抗炎、抗凋亡和器官保护的作用机制。方法:小鼠巨噬细胞系RAW264.7购买于美国ATCC公司,复苏后培养于含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基中,置于37℃、5%CO₂的孵育箱中。细胞贴壁培养于培养瓶或培养皿,待密度为80%左右时,细胞刮刮下吹打成单细胞悬液以1:3¹:6传代培养,培养基每两天更换一次,细胞以2×10⁵ cells/mL的密度随机接种于培养板或培养皿中,整个实验分为四个部分。第一部分实验分为Con组和不同时间LPS处理组共七组,LPS组给予LPS处理,Con组给予同样体积的PBS缓冲液。分别于LPS处理的4h、8h、12h、16h、20h和24h,提取细胞蛋白,Western Blotting检测LC3和P62的表达变化,确定自噬的高峰时间段。然后在高峰时间给予3-MA和RAPA,用CCK8检测细胞增值活性,观察干预自噬对巨噬细胞损伤的影响。第二部分实验分组和处理与第一部分相同,时间选择自噬的高峰时间点。首先检测上清液中细胞炎症因子的分泌量。其次检测细胞内ATP的水平、ROS的含量以及线粒体膜电位和Tom20的表达,分别从线粒体的质量和重量对线粒体网络功能进行评估,再通过Western Blotting检测Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3的表达,观察细胞凋亡相关蛋白在LPS处理的巨噬细胞中的表达变化。第三部分实验分为两个小部分:1、细胞分组、处理及时间第二部分相同。采用Western Blotting检测线粒体自噬蛋白PINK1和Parkin的变化,共聚焦荧光检测PINK1和Tom20的定位表达,透射电镜观察线粒体的形态和线粒体自噬的发生;2、实验分为siCon组、siCon+LPS组、siPINK1组和siPINK1+LPS组,siCon转染的为空白质粒,siPINK1转染的为针对干扰PINK1的shRNA,LPS为给予LPS处理,各组体积用PBS缓冲液补齐。然后检测抑制PINK1的表达对LPS处理的巨噬细胞炎症、凋亡和线粒体功能的影响。第四部分实验分为两个小部分:1、实验分为Con组、DEX组、LPS组、LPS+DEX组和LPS+DEX+Ati组,LPS组给予LPS处理,DEX组给予右美托咪定（1μM）处理,DEX在给予LPS后加入培养基中,Ati为给予阿替美唑（10nM）处理,在给予DEX处理后加入到培养基中。各组体积用PBS缓冲液补齐。给予干预处理12h后,检测DEX对LPS处理的巨噬细胞的炎症反应、细胞凋亡和自噬的影响;2、实验分为siCon+LPS组、siCon+LPS+DEX组、siPINK1+LPS组和siPINK1+LPS+DEX组,转染处理与第三部分相同,LPS和DEX干预处理与第四部分第1小部分相同。给予干预处理12h后,检测抑制PINK1的表达对右美托咪定保护作用的影响。结果:第一部分实验结果:LPS处理巨噬细胞诱导自噬发生,在12h¹6h之间达到高峰（P<0.05）。使用3-MA抑制自噬,细胞活力降低（P<0.05）;使用低浓度RAPA促进自噬,细胞活力升高（P<0.05）;使用高浓度RAPA促进自噬,细胞活力降低（P<0.05）。第二部分实验结果:LPS处理巨噬细胞引起细胞炎症反应、线粒体功能受损,发生线粒体依赖性细胞凋亡（P<0.05）。第三部分实验结果:LPS处理巨噬细胞引起线粒体自噬发生,使PINK1和Parkin表达增多（P<0.05）;抑制PINK1的表达,加重LPS处理引起的巨噬细胞损伤（P<0.05）。第四部分实验结果:右美托咪定可以减轻炎症反应、促进自噬和受损线粒体的清除、改善线粒体网络功能、抑制细胞凋亡（P<0.05）;抑制PINK1的表达削弱右美托咪定的保护作用（P<0.05）。结论:LPS处理可以引起巨噬细胞损伤,而PINK1介导的线粒体自噬对巨噬细胞损伤具有保护作用;右美托咪定可以减轻LPS导致的巨噬细胞损伤,且其保护性作用依赖于PINK1介导的线粒体自噬。