论文部分内容阅读
人类许多慢性疾病及衰老现象均和人体内的自由基水平失衡有关,外源性抗氧化剂可以帮助人们维持体内自由基的平衡。通过对具有抗氧化活性的天然食物进行研究、筛选和改性有可能开发出有效的抗氧化药物和保健食品。乌骨鸡具有特殊的营养滋补和药用价值,是优良的蛋白质源。本论文研究了乌骨鸡多肽抗氧化活性的检测方法,乌骨鸡蛋白的酶解工艺条件和乌骨鸡多肽中具有羟自由基清除活性的多肽的分离纯化。1.建立了乌骨鸡多肽体外抗氧化活性的检测方法。在对乌骨鸡蛋白水解液成分分析的基础上,检测了乌骨鸡蛋白水解液的抗氧化能力,包括清除超氧阴离子、清除羟自由基、清除DPPH自由基、还原能力和防止脂质过氧化等方面的能力。实验结果表明,乌骨鸡蛋白水解液在不同检测系统中均具有抗氧化能力,尤以对羟自由基的清除活性最高,具有很好的开发利用前景。2.确定了乌骨鸡蛋白进一步酶解的最佳工艺条件。以羟自由基清除活性为指标,经过单酶实验,得到最佳水解用酶:胰蛋白酶。经过L16(45)的正交试验,确定了胰蛋白酶的最佳酶解条件:温度50℃,初始pH8.5,E/S为6000U/g,酶解时间6h,底物浓度为9%。采用该工艺获得的多肽对羟自由基清除率为45.4%(肽浓度为33.3μg/mL),比同一条件下Vc的羟自由基清除率高4%。3.以羟自由基清除活性为指标,分离纯化了抗氧化肽。确定了Sephadex G-25凝胶层析对乌骨鸡多肽的最佳分离条件:洗脱液为去离子水,1.0mL/min的洗脱速度,50mg/mL的上样浓度,0.30mL上样量,此时乌骨鸡多肽能被分离出5个峰,其中第四峰(D峰)具有最高的羟自由基清除能力,其IC50为34.3μg/mL。确定了离子交换层析对D峰的最佳分离条件:使用Fractogel EMD TMAE柱,上样量为1mL,缓冲液pH9.5时采用线性梯度洗脱。此时D峰被分为三个峰,其中D3峰具有最高的羟自由基清除能力,其IC50为13.1μg/mL,是初始羟自由基清除活性的3.95倍,也是Vc羟自由基清除活性的4.67倍。D3峰的HPLC分析表明D3峰不是单一的物质,含有至少三种组分。D3峰的氨基酸分析表明,D3峰主要由Tyr、Leu、Lys、Arg及Ala等氨基酸组成。