二十碳五烯酸(EPA)是一种n-3系列长链不饱和脂肪酸,具有降低血脂、抗癌、抗炎症等生理功能。目前,EPA主要来源于深海鱼油,已难以满足日益增强的市场需要。因此,寻找新的经济有效的EPA来源是目前研究的热点。华丽腐霉因其易于培养、生长周期短、EPA含量相对较高,是具有应用前景的EPA生产菌株,但仍存在碳源利用率低和生物量不高等问题,导致EPA产量不高。因此,本文通过揭示EPA合成途径,并确定EPA合成的关键酶及其主要影响因素,针对性地建立相应的调控措施,从而提高EPA产量,为华丽腐霉EPA产业化应用提供了理论和实验依据。取得的主要创新性研究结果如下:(1)基于油脂代谢组学分析,确定了华丽腐霉EPA合成途径及其关键酶。通过添加外源脂肪酸前体物(亚油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸),利用油脂代谢组学分析其所引起的脂肪酸组成及含量的变化,发现华丽腐霉EPA合成途径包含特殊的“D8合成途径”及其代谢产物,它是n-3途径的必需组成部分,也是n-6途径的补充途径。同时,阐明了该菌株EPA合成主要路径是n-6途径,n-3途径和D8途径仅为辅助路径。进一步对各种不同培养条件下脂肪酸组成的变化进行分析,初步确定Δ12、Δ6、Δ17脂肪酸脱氢酶是EPA合成的限速酶;并通过增强以上三种酶的基因D12、D6或D17在华丽腐霉中的表达,构建了三种单价基因转化菌株,发现D12、D6或D17的超表达,可分别显著降低油酸(OA)、亚油酸(LA)或花生四烯酸(ARA)的发酵产量,显著促进n-6途径中EPA合成,进一步确定Δ12、Δ6、Δ17脂肪酸脱氢酶为EPA合成的关键酶。(2)通过研究华丽腐霉EPA主要合成途径及其关键酶的主要影响因素,确定了提高EPA产量的发酵调控措施。研究发现,在葡萄糖95 g/L的发酵培养基中添加5 g/L甘露醇,同时将无机氮源(NaNO3)添加量控制在4.5 g/L,并在发酵72 h后于培养基中添加豆芽汁64.45 g/L、柠檬酸1.50 g/L、谷氨酸0.19 g/L以及亚麻籽油8 g/L,可使华丽腐霉的生物量达39.47 g/L、EPA产量达1120 mg/L。较未调控前,生物量、EPA产量依次提高199.6%和511.4%,且碳源利用率提高了35.6%。因此,确定了采取添加甘露醇调节渗透压促进碳源利用、控制无机氮源添加量促进油脂合成,以及强化三羧酸循环转运体系(CTS)和n-6代谢途径等有效措施,解决了华丽腐霉生长受制、碳源利用率低的问题,大幅提高了EPA产量。(3)研究了华丽腐霉发酵的流变学特征。通过测定华丽腐霉不同发酵时间的生物量和发酵液黏度,进行发酵过程的流变特性分析,建立了华丽腐霉发酵的流变动力学方程,发现华丽腐霉发酵液为假塑性非牛顿性流体,且稠度系数、流变指数与华丽腐霉生物量之间分别呈指数关系和线性关系,为华丽腐霉发酵放大提供了指导。(4)基于华丽腐霉发酵的流变特征,进行了发酵罐操作因素对EPA发酵影响的分析,并建立了中间补料和分三阶段控氧等调控措施。(1)分段溶氧控制:对华丽腐霉发酵各阶段溶氧需求分析,建立了DO0-48 h=15%,DO48-96 h=20%和DO96-168 h=15%三段式溶氧控制;(2)中间补料:在氮源消耗殆尽(发酵96 h)时添加0.3 g/L的NaNO3,以及将64.45 g/L的豆芽汁在72 h、120 h和144 h分三次补加至发酵培养基,每次补加浓度约为21.5 g/L,不仅可有效提高苹果酸脱氢酶(ME)活性,导致CTS代谢通量的增强,促进菌体内NADPH生成,还能有效缓解发酵后期NADPH供给不足的问题,从而解决了乙酰辅酶A转运和脂肪酸脱氢反应受制的问题,促进了油脂和EPA合成。通过以上发酵调控措施的实施,可实现既能产生较高的生物量,又能累积较高的EPA的目的,最终可获得1440 mg/L的EPA,比摇瓶水平提高128.6%。(5)华丽腐霉合成EPA的三个关键酶表达量及其调控对EPA产量的影响分析。研究发现,发酵调控对D12基因表达量的影响较小,故D12基因表达量偏低是限制EPA产量进一步提高的关键因素。为此,进一步采用华丽腐霉D12基因转化菌发酵,并结合上述优化的发酵调控措施,可在摇瓶和10 L发酵罐中分别将EPA产量提高至1370 mg/L和1640 mg/L,较出发菌株为调控前,EPA产量分别提高6.3倍和7.5倍。以上研究结果为促进EPA的产业化应用打下了坚实的理论和实验基础。