恶性肿瘤严重威胁人类生命健康,已成为人类最主要的致死疾病之一。据全国肿瘤防治研究办公室的统计数据表明,我国每年新发癌症病例为350万,因癌症死亡的有250万。化学疗法是目前治疗癌症的重要手段之一,但是临床上的化疗药物在杀死癌细胞的同时也损伤了机体正常细胞的功能,导致严重的副作用,降低了患者的生存质量。此外,癌细胞对化疗药物易产生耐药性,常常导致化疗失败。因此,迫切需要寻找高效、低毒的新型肿瘤治疗药物。大量研究表明,多糖具有广泛的药理学活性,包括抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗衰老等。其中,多糖的抗肿瘤和免疫调节活性研究受到越来越多的关注。多糖主要从两个方面发挥抗肿瘤作用：作为生物反应调节剂激活机体的免疫反应间接发挥抗肿瘤活性；通过引起细胞应激,调控肿瘤细胞中癌基因表达等诱导肿瘤细胞分化、凋亡、细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞的增殖和转移,发挥直接抗肿瘤作用。黑根霉Rhizopus nigricans是一种接合菌门丝状真菌,具有优异的生物转化功能,被广泛应用于食品和医药工业。研究发现,通过液体发酵获得的黑根霉菌丝体中含有大量活性多糖组分,具有良好的药理活性。本文以实验室分离保藏的一株黑根霉为材料,从其液体发酵菌丝中分离纯化活性多糖组分,研究其结构特征、抗肿瘤活性和免疫调节活性。以上研究旨在阐明黑根霉菌丝体多糖抗肿瘤活性和免疫调节活性的分子机制,为将其开发成为一种治疗或辅助治疗癌症的药物奠定基础。1.黑根霉菌丝体多糖的制备和结构表征采用水热浸提、乙醇沉淀、Sevag脱蛋白、D301R大孔树脂脱色,从黑根霉菌丝体中获得粗多糖。经Sephadex G-100凝胶柱层析,从粗多糖中分离获得黑根霉菌丝体多糖RPS,RPS的单糖组成和摩尔比为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：岩藻糖=5.1：1.0：1.6：92.2：1.3：2.3。另外,采用DEAE-Sepharos Fast Flow阴离子交换凝胶层析和Sephacryl S-500 HR分子筛凝胶层析从粗多糖中分离纯化获得一种均一的水溶性非淀粉多糖,命名为RPS-1。高效尺寸排阻色谱联用多角度激光散射分析表明RPS-1的重均分子量为1.617×107g/mol,多分散系数为1.332,均方根旋转半径为24.2 nm。红外光谱结果显示RPS-1具有多糖的特征吸收峰。PMP柱前衍生化方法分析RPS-1的单糖组成,结果显示RPS-1只含有葡萄糖一种单糖。甲基化分析结果表明,RPS-1糖链中含有α-Glcp-(1→ α-Glcp-(1→和→4)--Glcp-(1→三种连接方式,摩尔比例为6.9：86.1：6.9。1HNMR核磁共振谱图的异头质子信号区域显示两个共振峰,δ5.35 ppm和4.92ppm分别归属为→4)-α-Glcp-(1→和α-Glcp-(1→的异头碳质子信号。13C NMR核磁共振谱图中,δ99.86 ppm为→4)-α-Glcp-(1→的C-1共振峰,且位于α-型糖苷异头碳的共振信号范围内。δ76.95 ppm为发生取代的C-4共振峰,δ60.58 ppm是葡萄糖残基的未取代的C-6共振峰,δ69.43 ppm是葡萄糖残基发生取代的C-6共振峰。根据以上结果我们推断,RPS-1是以→4)-α-D-Glcp(1→为主链并在其O-6位产生支链的非淀粉葡聚糖,平均每14.5个葡萄糖出现1个→4,6)-α-Glcp-(1→残基。2.黑根霉菌丝体多糖RPS的抗肿瘤活性研究多糖具有复杂的空间结构和多样的生物活性,可以在体外直接作用于肿瘤细胞,干扰细胞的新陈代谢、抑制其分裂增殖。本文研究了RPS对人胃癌BGC-823细胞的抗肿瘤活性,并初步探讨了其可能的作用机制。MTT结果显示,RPS处理12h、24、48h可以显著抑制BGC-823细胞生长。集落克隆实验结果显示,600μg/ml的RPS可以显著抑制BGC-823细胞集落形成,抑制率为70%。Hoechst33258染色、AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术分析结果显示,RPS诱导BGC-823细胞发生凋亡性细胞死亡。细胞周期分布检测结果显示,RPS可以阻滞肿瘤细胞于G2/M期。进一步的研究发现,RPS可以诱导BGC-823细胞线粒体膜电位的下降,提高细胞内活性氧含量。Caspase-9是线粒体凋亡通路的关键蛋白酶,位于线粒体通路中caspase瀑布式级联激活反应的顶端,600 μg/ml浓度的RPS处理组的caspase-9活性是对照组的1.72倍。PCR检测结果显示,RPS处理12h后,Bcl-2的nRNA的表达量随着RPS浓度的升高不断降低,然而Bax的mRNA表达量随着RPS浓度的升高不断增加。这些结果表明,RPS通过线粒体途径诱导人胃癌BGC-823细胞发生凋亡。我们还发现,RPS可以提高BGC-823细胞内游离钙离子浓度,上调GRP78、ATF6、CHOP和spliced-XBP1的mRNA表达水平,表明内质网应激可能也参与了RPS诱导BGC-823细胞凋亡。3.黑根霉菌丝体多糖RPS-1的免疫调节活性研究巨噬细胞是最重要的吞噬细胞和抗原呈递细胞之一,在机体免疫响应中发挥重要作用。因此,本文选择小鼠巨噬细胞RAW 264.7为材料,研究RPS-1的免疫调节活性。MTT检测结果表明,RPS-1在25-800 μg/ml浓度范围内对巨噬细胞没有细胞毒性。采用Griess法和ELISA分别测定NO和TNF-a的含量,结果表明RPS-1能显著促进巨噬细胞分泌NO和TNF-a,流式细胞术检测结果表明RPS-1可以增强巨噬细胞吞噬能力。。PMB可以特异性和内毒素结合,阻断其对巨噬细胞的刺激作用。PMB预处理不影响RPS-1刺激巨噬细胞分泌NO和TNF-a,说明RPS-1中不含内毒素污染。为了探明RPS-1激活巨噬细胞的信号通路和分子机制,我们采用免疫荧光染色、荧光素酶报告基因检测和western blot检测细胞内NF-κB、MAPk、Akt通路相关蛋白的表达。实验结果显示,RPS-1可以时间依赖性的诱导巨噬细胞内IκBα的降解和NF-κB p65的核移位,浓度依赖性的提高NF-κB转录活性。使用NF-κB通路特异性抑制剂BAY11-7082 (10μM)几乎完全抑制RPS-1诱导巨噬细胞分泌NO和TNF-a,表明NF-kB是参与RPS-1激活巨噬细胞的重要转录因子。我们还发现,RPS-1提高了p38、JNK、ERK和Akt的磷酸化水平。MAPK通路抑制剂PD98059(30μM)、SP600125(20μM)以及PI3K/Akt通路抑制剂LY294002(50μM)可以不同程度的抑制RPS-1诱导的NO和TNF-α分泌,然而p38通路抑制剂SB203580 (10μM)对RPS-1诱导的NO分泌没有影响。在不同的细胞类型和刺激因素下,MAPK通路和PBK/Akt通路之间存在着复杂的相互作用。我们发现,MAPK抑制剂预处理巨噬细胞30min后,RPS-1诱导的Akt磷酸化水平出现不同程度的下降,PBK/Akt抑制剂LY294002预处理可以明显降低JNK的磷酸化水平,但是对p38和ERK的磷酸化水平没有明显的影响,表明p-JNK和p-Akt在RPS-1激活巨噬细胞过程中存在着交互作用。RPS-1可以提高CT26结肠癌荷瘤小鼠的免疫器官指数、血清细胞因子含量和CD8+T淋巴细胞比例,抑制肿瘤生长,和5-FU联用还具有减毒增效的作用。综上所述,黑根霉菌丝体多糖RPS通过诱导线粒体途径细胞凋亡和G2/M期阻滞抑制人胃癌BGC-823细胞的增殖；黑根霉菌丝体多糖RPS-1是以→4)-α-D-Glcp(1→为主链并在其O-6位产生支链的非淀粉葡聚糖,可以通过NF-κB、MAPK和PI3K/Akt通路促进巨噬细胞分泌NO和TNF-α,提高CT26结肠癌荷瘤小鼠的免疫功能,抑制移植瘤生长,和5-FU联用还具有减毒增效的作用。