尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1 (UGTIAI)是人体内重要的Ⅱ相代谢酶,肩负着内源性毒性代谢物胆红素和多种外源性底物代谢清除的重任,UGT1A1活性的失常与人体多种疾病的发生甚至死亡相关,如高胆红素血症、黄疸、肝毒性和神经毒性等,同时影响着个体化用药的方案。准确评价和表征复杂生物体系中UGT1A1活性十分重要。目前UGT1A1的活性定量评估是借助内源性或外源性底物如胆红素和药物性底物的代谢产物生成量的定量来实现。这些底物存在着选择性、灵敏性、稳定性、抗干扰性等实用性等问题,随着生物体系的复杂性和面对的实际应用条件的不同,UGT1A1的活性定量已成为本领域面临的一大挑战。荧光探针分子具有高灵敏性、高通量、高分辨及原位检测等优势,可以克服上述传统非荧光探针分子的缺陷。然而,多数荧光分子经UGT1A1代谢后,生成的代谢产物荧光光学属性通常会消失,其荧光光学属性通常会明显减弱甚至消失,这是设计UGT1A1荧光探针分子的首要难点。此外,UGT是膜蛋白酶,需要在膜体系完整存在以及辅因子存在的情形下,才能实现活性定量或者原位显示。所设计的荧光探针需要能够对抗复杂基质的干扰。因此,本论文选择高灵敏性的荧光母核设计系列化合物,通过UGTs酶选择性优化,获得兼顾多种应用目标即高灵敏性、高选择性、抗复杂基质干扰的UGT1A1荧光探针分子。主要研究结果如下：(1) UGT1A1 OFF-ON型荧光探针的构建。针对UGT1A1易催化多环酚类物质的特性,以光学属性良好的1,8-萘酰亚胺荧光分子为母体,通过延伸1,8-萘酰亚胺母核的π共轭体系,合成了3个羟基空间位置不同的羟苯基-1,8萘酰亚胺类新型化合物。借助体外人肝微粒体(HLM)和重组UGTs单酶代谢孵育体系,开展体外UGT1A1选择性评估,总结系列荧光分子结构-UGT1A1选择性规律,发现N-位置对位酚羟基的取代能够显著提高UGT1A1的催化选择性。上述化合物中N-(正丁基)-4-(4-羟苯基)-1,8-萘酰亚胺(NPHN)选择性最高,在众多UGTs亚型中仅被UGT1A1代谢。NPHN本身无荧光,但其代谢产物(NPHN-O-葡萄糖醛酸苷)有荧光,发射波长520 nm,斯托克斯位移150nm,说明NPHN为UGT1A1开关型荧光探针。利用NPHN测定了14例个体HLM样本中UGT1A1酶活,发现与传统探针测得UGT1A1活性高度相关(R2>0.9),且14例人肝样本的UGT1A1活性个体差异将近10倍。利用NPHN实现了人源HepG2细胞水平UGT1A1的生物成像。总之,NPHN为高选择性、高灵敏度的OFF-ON UGT1A1荧光探针分子。(2) UGT1A1比率型荧光探针的构建。考虑到OFF-ON荧光探针在实际应用中定量误差较大,比率型荧光探针通过发射波谱的蓝移或红移则可用于比率检测,此时探针分子原型可作为内标来减小光照强度、探针浓度等对定量分析的影响,有必要研发更为实用的UGT1A1比率型荧光探针。因此,不同于上述延伸1,8-萘酰亚胺母核的π共轭体系的修饰策略,通过改变4-羟基-1,8-萘酰亚胺母核N-取代基团,合成了不同N-端结构修饰的系列萘酰亚胺类化合物共15个。借助体外HLM和重组UGTs单酶代谢孵育体系,开展体外UGT1A1选择性评估,总结系列荧光分子结构-UGT1A1选择性规律,发现N-位置酸性取代基团的引入能够显著提高UGT1A1的催化选择性。上述化合物中N-(3-羧丙基)-4-羟基-1,8-萘酰亚胺(NCHN)选择性最高,其对UGT1A1的选择性是其它UGTs亚型的26倍。NCHN及其代谢产物(NCHN-4-O-葡萄糖醛酸苷)具有不同的光学属性,为比率型荧光探针。利用NCHN测定了14例个体来源HLM样本中UGT1A1活性,发现与传统探针测得UGT1A1活性高度相关(R2>0.9),14例人肝样本的UGT1A1活性个体差异将近10倍。利用NCHN实现了人源肝脏肿瘤HepG2细胞水平UGT1A1的生物成像。总之,NCHN克服了传统UGT1A1特异性探针分子存在多个代谢位点、低选择性及低灵敏性的问题,为高选择、高灵敏比率型UGT1A1荧光探针。(3) UGT1A1抑制剂的高通量筛选。为了研究UGT1A1与配体相互作用关系,同时,探索中药中对UGT1A1的影响成分,我们使用上述UGT1A1比率型荧光探针NCHN,建立UGT1A1抑制剂的高通量筛选方法。选取中药补骨脂作为模式复杂中药成分,建立补骨脂的液相色谱-紫外检测(LC-UV)指纹图谱与UGT1A1活性酶标检测的同步筛选技术。发现补骨脂五个主要成分对UGT1A1活性有明显抑制作用,其中补骨脂二氢黄酮和补骨脂甲素抑制作用较强,抑制常数Ki小于1.0μM,新补骨脂异黄酮、补骨脂乙素和补骨脂二氢黄酮甲醚呈现中等强度UGT1A1抑制活性,Ki值为1.61～10μM之间。同时,使用传统非特异性UGT1A1探针4-甲基伞形酮(4-MU)作为阳性对照探针,平行测定补骨脂中五个主要成分对UGT1A1的抑制行为及抑制动力学参数,发现该五个成分对UGT1A1表现出相似的抑制趋势和不同的抑制动力学行为。以上结果提示,该方法可以用于中药复杂组分中UGT1A1抑制剂的高通量筛选,补骨脂中含有UGT1A1抑制剂,可能引发药物-草药相互作用,且NCHN和4-MU与UGT1A1可能具有不同的活性作用位点。(4)两种荧光探针UGT1A1活性位点代表性底物的初探。为探索不同的配体与UGT1A1的结合位点、配体与UGT1A1的相互作用关系,NPHN和NCHN是否可以成对用于UGT1A1抑制介导的药物／草药-药物相互作用研究,我们通过酶化学抑制动力学实验抑制类型的判断(竞争性抑制、非竞争性抑制)和酶突变体动力学实验酶活力的比较,对NPHN和NCHN是否使用UGT1A1酶的同一活性位点进行了初探。研究结果表明荧光探针NCHN和NPHN分别占据UGT1A1不同的活性位点,提示NCHN和NPHN可以作为UGT1A1不同活性位点的代表性底物成对使用,用于检测生物样本中的UGT1A1活性,避免临床上UGT1A介导的不良药物-药物相互作用。综上所述,本论文筛选获得了两种不同类型(OFF-ON开关型荧光探针和比率型荧光探针)的高选择性、高灵敏性的UGT1A1荧光探针分子,实现了UGT1A1酶活的高通量测定,人源肝细胞系中UGT1A1的生物成像及中草药中UGT1A1抑制剂的高通量筛选。此外,初探了这两种UGT1A1荧光探针分子与UGT1A1的活性位点的关系,提示了两种探针可能有不同的应用价值。该研究通过理性设计,获得UGT1A1酶活性表征的荧光探针,为兼顾高通量和高内涵的UGT1A1酶活性表征及其介导的毒性研究等奠定了坚实的基础。