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目的：通过RNA反向遗传学操作,克隆人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)反基因组cDNA,并构建以T7RNA多聚酶(T7RNA polymerase, T7RNP)为启动子、插入有绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein, EGFP)的RSV反基因组cDNA重组质粒pBRAT-RSV-EGFP,通过MVA-T7痘苗病毒等提供T7RNP,探讨拯救可表达EGFP的重组人呼吸道合胞病毒(rRSV/EGFP)的条件。方法：利用分子病毒学和分子生物学技术,以经过改造的pBR322质粒为克隆载体,通过多步克隆操作,获得编码RSV反基因组的cDNA克隆,并且将EGFP表达盒插入到RSV反基因组cDNA扣,构建重组RSV反基因组质粒pBRAT-RSV-EGFP。克隆的反基因组cDNA位于T7启动子下游和丁肝核酶(HDV ribozyme,δ)以及T7转录终止信号的上游,经核酸内切酶及核酸序列分析后,分别用MVA-T7病毒、BSR T7/5细胞和pcDNA3.1-T7RNP质粒提供T7RNP,同时转染pBRAT-RSV-EGFP,经转录获得重组RSV单股正链的反基因组,以可表达四种RSV核衣壳蛋白或多聚酶蛋白的质粒pcDNA3.1-N-OPT、pcDNA3.1-P-OPT、pcDNA3.1-M2-1-OPT和pcDNA3.1-L-OPT为辅助质粒,并共转染至BSR T7/5细胞或瞬时表达T7RNP的HEp-2拯救rRSV/EGFP,观察绿色荧光表达情况评估拯救的条件。结果：经核酸内切酶及核酸序列分析证实,RSV反基因组cDNA及插入有EGFP的RSV反基因组cDNA克隆及其重组质粒均成功获得。与BSR T7/5细胞和pcDNA3.1-T7RNP质粒相比,以MVA-T7感染HEp-2细胞,能够高效提供T7RNP,是用于重组RSV拯救的有效方法。结论：成功克隆及构建了可表达EGFP的RSV反基因组cDNA及其重组质粒,并对拯救体系进行了比较研究,这些工作为最终实现重组RSV的成功拯救提供了有益的经验。