土茯苓Rhizoma Smilacis Glabrae为百合科植物土茯苓Smilax glabra Roxb.的干燥根茎,最早记载于《神农本草经》附录,使用历史悠久,是中医临床上的常用中药之一。中药土茯苓味甘、淡、性平,具有清热除湿,泄浊解毒,通利关节等功效,临床上主要用于治疗梅毒,泄泻,淋浊,脚气,筋骨挛痛,痈肿,瘰疬,疮癣,瘿瘤以及金属汞中毒等,已经有上千年的使用历史。目前对于土茯苓的研究,大多局限于传统的制剂研究,工艺优化和药理作用的发现,对于深入的研究,如采用先进的提取技术手段对土茯苓进行预处理、对其进行深入的药效物质基础研究和全面的体内代谢转化过程研究等的报道较少。本研究采用先进的样品前处理技术,以多维色谱-组合质谱法作为研究技术和手段,在实现土茯苓现代化提取、分离和鉴别以及制备技术平台建立的基础上,对土茯苓体外质量标准的确立和极性化合物组活性筛选进行了深入的探讨。本文首先采用单因素法对使用加速溶剂萃取法(以下简称ASE)对土茯苓中的主要化学成分的提取进行了优化,利用高效液相色谱-组合质谱技术鉴定出土茯苓中的多种化学成分。然后采用大孔吸附树脂切割土茯苓醇提取液为两个不同极性化合物组,并用水提醇沉法得到土茯苓多糖组,在分别建立高尿酸血症小鼠模型和铅中毒wistar大鼠模型的基础,以考察和筛选土茯苓上述化合物组降尿酸和促排铅作用的药效物质基础,再进一步采用高速逆流法结合制备色谱技术对其中的活性单体进行制备。在此基础上,今后可以进一步考察土茯苓提取液在wistar大鼠血浆和尿液代谢谱,以此考察土茯苓在大鼠体内的吸收和转化过程,推测可能的代谢途径,为土茯苓的进一步开发和利用,制备出疗效好、毒性小的新型药物奠定科学基础。本文的研究内容具体如下:一、加速溶剂萃取法结合HPLC-PDA-ESI-ITMSn/TOF-MS技术建立土茯苓定性指纹谱本章首先对现代化萃取技术ASE法提取土茯苓中的有效成分进行了全面的考察,通过单因素法考察了提取温度、提取时间、提取溶剂、固液比、循环次数对土茯苓中化合物提取率的影响。研究结果表明,用ASE法,提取时间4min,在40℃的提取温度为下,用20%乙醇为提取溶剂,固液比为0.5/10(g/ml)时1次循环就能实现对土茯苓药材中的六种活性成分的最大量提取。进一步与传统的提取方法加热回流法和超声提取法进行比较,采用文献报道中的最优化条件进行活性成分的提取,发现ASE法具有萃取时间短、提取温度低、有机溶剂量比例小和结果的重现性高的优点。从而为土茯苓的提取又探索出一条新的绿色环保高效的途径。在此基础上,采用HPLC-PDA-ESI-IT/MSn技术对土茯苓ASE法提取液中的化合物进行分离和定性鉴别,对鉴别出的8种化合物采用UPLC-TOF-MS技术进行进一步的分子量和结构的确认,对文献报道中某些色谱峰对应的化合物相互矛盾的现象进行了辨识,从而对土茯苓的体外质量控制和作用机制研究提供了有力的保障。二、土茯苓降血尿酸和排铅作用的研究和活性化合物的制备土茯苓具有清热解毒,除湿通络的功效,临床上常用于高尿酸血症和痛风的治疗。土茯苓解毒排重金属早有记载,近年来,人们开始研究以土茯苓为主药的中药复方和制剂对铅的促排作用。尽管如此,土茯苓排铅和降尿酸的作用物质基础仍不明确。本章首先将土茯苓醇提取物通过大孔吸附树脂分离切割成两部分,土茯苓小极性化合物组和土茯苓中极性化合物组,并运用加热回流水提醇沉法制备出RSG多糖化合物组。然后建立高尿酸血症的小鼠模型,以别嘌呤醇作为阳性对照药,对土茯苓各极性化合物组进行降尿酸实验研究,筛选降尿酸的土茯苓有效化合物组。结果发现,土茯苓中极性化合物组具有良好的降尿酸活性,中极性化合物组与阳性对照组之间没有统计学上的差异(P>0.05)。通过测定各组小鼠的肝脏黄嘌呤氧化酶的活性(XOD),发现土茯苓中极性化合物组和阳性对照组小鼠肝脏的XOD均有所下降,中极性化合物组和阳性对照组相比也没有统计学上的差异(P>0.05)。上述结果表明土茯苓中极性化合物组降低小鼠体内血尿酸的作用机制有可能与别嘌呤类似均是通过抑制XOD活力以此来抑制尿酸的生成而实现的。另外建立wistar大鼠慢性铅中毒模型,以二巯基丁二酸(DMSA)为阳性对照药,对土茯苓各极性化合物组和多糖组进行排铅实验研究,通过测定给药前后染铅大鼠血铅、尿铅和肝脏、心脏、肾脏、脑、脾脏和股骨中的铅含量,C从而筛选出促进大鼠体内铅排出的RSG有效化合物组。研究发现,用药21天后,与用药前相比,各用药组大鼠体内的血铅含量,肝脏、脾脏和肾脏内的铅含量均有所下降,且各器官内的铅含量用药前后相比均有极显著性差异(P<0.01);另外,除了阳性对照组外,小极性化合物组的大鼠心脏内的铅含量下降;小极性化合物组和中极性化合物组中大鼠股骨内的铅含量下降;中极性化合物组中大鼠脑部铅的含量下降,且各组用药前后相比在统计学上均有显著性的差异(P<0.05)。在药效活性筛选的基础上,对土茯苓中极性化合物组采用分析型高速逆流色谱技术结合制备液相色谱法制备出4个活性单体,即落新妇苷(astilbin),异落新妇苷(isoastilbin),新落新妇苷(neoastilbin)和新异落新妇苷(isoneoastilbin)。从而建立了基于药效试验的土茯苓活性单体的规模化制备的多维切割-高速逆流色谱分离-制备液相色谱纯化分析技术平台。三、结合模式识别建立土茯苓体外指纹图谱和多组分质量控制土茯苓药材植物来源广泛,不同产地的产品化学成分的差异很大,严重影响临床疗效,至今没有统一的质量标准和多组分定量依据。本章采用现代化的提取技术ASE法和分离分析技术HPLC法,建立了来自全国不同生产地区不同批次的16批土茯苓样品的高效液相指纹图谱,并结合模式识别法对它们进行了质量评估。首先采用聚类分析把16批样品分成两组,4批归为合格样品组,12批归为不合格样品组。再用相似度分析软件对12批合格样品进行分析,用相关系数法进行计算,结果显示这12批合格样品表现出相似的色谱模式,能够准确地反映出RSG样品的实际质量状况。再将16批RSG样品的典型HPLC色谱图用中心尺度化的主成分法分析法进行分析,所得的得分图的结果与聚类分析一致,从得到的载荷图中确定了一些用于区分土茯苓质量的变量即化合物,将其中能够获得对照品的6个黄酮类化合物作为定量指标。在此基础上,对12批合格土茯苓样品进行定量分析,以全面的评价土茯苓的品质。结果发现,不同批次的RSG样品中6个黄酮类化合物的含量相差很大。因此,多组分定量测定土茯苓中活性化合物的含量对质量控制具有重要意义。经典的中药指纹图谱与模式识别法相结合可全面的评价中药质量,并为选择定量指标提供了依据。综上所述,本课题利用现代化技术手段,实现了土茯苓降血尿酸和促排铅的各化合物组的活性筛选,建立了基于药效实验的RSG药材中的主要活性化合物的高效提取、快速分离、定性鉴别、规模化制备、全面有效的质量控制研究的技术平台,初步揭示了RSG降低血尿酸水平和促进体内铅排出的物质基础。