Notch1通路介导自嗤调控反复着床失败子宫内膜容受性的研究

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背景胚胎着床是正常妊娠建立的关键步骤之一,是活化状态的囊胚与接受态的子宫相互作用并建立紧密联系的过程。体外受精(in vitro fertilization,IVF)的成功率很大程度上取决于胚胎着床。缺乏发育能力的非整倍体胚胎可能是着床失败的主要原因,然而大约1/3形态正常的整倍体囊胚也无法成功着床,这提示着子宫内膜容受性在胚胎着床中具有重要的作用。据报道约10%的患者在多次IVF治疗后出现原因不明的反复着床失败(recurrent implantation failure,RIF),是辅助生殖技术(assisted reproduction technology,ART)领域亟待解决的一大临床难题。目前,反复着床失败在临床上尚无普遍接受的定义,多是指40岁以下的女性不孕患者经过至少3次新鲜或者冻融胚胎移植周期、累计移植至少4枚优质胚胎却仍未实现临床妊娠。反复着床失败的病因复杂,涉及配子或胚胎、子宫、输卵管积水、免疫、血栓形成等诸多因素,其发病机制尚不清楚。Notch信号通路是一种系统发育上高度保守的信号传导途径,在胚胎发生、细胞发育、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchyrmal transition,EMT)、血管生成等过程中发挥重要作用。Notch信号通路的某些分子或下游事件发生改变,都会导致病理状态的发生。已证实Notch1在子宫内膜细胞、胚胎、胎盘组织均有表达,并参与调控子宫内膜蜕膜化,进而影响胚胎着床。自噬是溶酶体介导的蛋白质降解的高度保守机制,是真核细胞进行自我消化降解的代谢过程,它通过循环氨基酸、减少受损蛋白质的数量和调节蛋白质水平响应细胞外信号,在维持细胞内稳态方面发挥着关键作用,在子宫内膜相关的生理和病理过程及胚胎着床过程中具有不可或缺的作用。然而,目前关于Notch1及自噬在反复着床失败患者的子宫内膜中的作用仍不清楚。目的探讨Notch1通路对子宫内膜细胞自噬及蜕膜化的影响,以及Notch1通路及自噬在反复着床失败子宫内膜中的表达,为探讨RIF发生发展的分子机制提供理论依据。方法1.采用免疫组化法分析自噬标记物LC3B在不同时期子宫内膜中的定位和动态表达差异;采用Western Blot法检测在增殖期、分泌中期子宫内膜组织及蜕膜组织中LC3B及P62的蛋白表达差异。2.利用人第三代子宫内膜基质细胞及子宫内膜腺癌Ishikawa细胞系,根据是否进行蜕膜化处理及加入Notch通路抑制剂(DAPT)分为:对照组、蜕膜化组、加DAPT对照组,加DAPT蜕膜化组。通过(Western Blot法检测LC3B及P62蛋白在各组的表达水平;通过RT-qPCR法比较Notch1通路相关分子及蜕膜化标志分子的mRNA表达水平。3.通过免疫组化法测定Notch1、LC3B在正常组和RIF组着床窗口期子宫内膜组织中的表达;通过Western Blot法检测两组子宫内膜组织中LC3B及P62的表达水平;通过RT-qPCR法检测两组子宫内膜组织中Notch1通路相关分子的mRNA表达水平。结果1.在子宫内膜组织中,LC3B主要定位在子宫内膜上皮细胞,在月经周期呈动态表达。LC3B在分泌中期的蛋白表达水平显著高于增殖期(P<0.05),P62在分泌中期的蛋白表达水平低于增殖期(P<0.05)。2.在第三代子宫内膜基质细胞中,蜕膜化组的LC3B蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)。加DAPT蜕膜化组LC3B蛋白表达较蜕膜化组有下降趋势(P>0.05),Notch1通路下游分子Hes1及蜕膜化标志分子IGFBP1、PRL的mRNA表达水平也下降(P<0.05)。在Ishikawa细胞系中,蜕膜化组的LC3B蛋白表达水平高于对照组(P<0.05),加DAPT蜕膜化组的LC3B蛋白表达水平与蜕膜化组相比有下降趋势(P>0.05)。3.Notch1蛋白在RIF组中的表达水平低于正常组(P<0.05),但LC3B蛋白在RIF组中的表达水平高于正常组(P<0.05)、P62蛋白的表达水平低于正常组(P<0.05)。RIF 组 Notch1 及 Hes1 的 mRNA 表达下降(P<0.05)。结论1.在正常子宫内膜的着床窗口期,Notch1通路上调,自噬水平升高。2.在反复着床失败子宫内膜的着床窗口期,Notch1通路下调,自噬水平升高。3.Notch1通路介导自噬异常可能是导致反复着床失败的重要原因之一。除Notch1通路外,其他因素也参与对反复着床失败子宫内膜的自噬及蜕膜化的调节,尚需进一步研究。
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