酿酒酵母全细胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的机理研究

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近十年来,随着发现糖类物质在细胞识别,免疫方面的重要生理作用,糖类物质又日益受到了重视并有了长足的进步。尤其是寡糖,它在生物体内起着调节细胞内外联系的作用,并参与激素的调节和抗体的免疫识别,能激活植物的自我防卫系统、诱导根瘤菌的固氮作用、可以与入侵的微生物上的糖蛋白相结合而阻止这些微生物对人体正常细胞的侵袭等等。尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺是合成寡糖的重要糖基供体,故有必要对糖核苷酸尤其是作为含有许多生理活性糖链链芯部分的N-乙酰葡糖胺供体的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的合成进行深入的研究。   本文研究了全细胞酿酒酵母催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法,以尿苷酸、葡糖胺和磷酸盐为底物,以果糖为能量供体,加入小分子化学效应物质,利用有透性的酵母细胞全细胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。   论文分别从膜透性,金属离子以及小分子效应物对UDPAG积累的影响等几个方面研究,结合析因实验和响应面分析对合成UDPAG的最佳反应条件及影响反应的各种因素进行了讨论。   新型促渗透剂15改变细胞通透性,显著提高了细胞透性,反应时间也由文献报道的12h缩短为8h,UDPAG的产量为对照的3倍以上;反应代谢通量经镁离子、钾离子和小分子效应物调节后,代谢途径流量分配发生了重大改变,分别提高了能量利用率、解决了反应的限速步骤。通过析因实验对11个因素进行考察,影响最大的因素分别为:磷酸二氢钠,温度,葡萄糖。再通过响应面设计优化实验,最佳反应条件为:尿苷酸7.0g/L,葡糖胺6.5g/L,维生素B10.026g/L,甘油15mL/L,氯化镁2.0g/L,氯化钾4.0g/L,磷酸二氢钠31.2g/L,醋酸钠5.0g/L,谷氨酰胺5.0g/L,烟酸0.01g/L,乙醛6.67mL/L,pH8.0,温度29℃,最优UDPAG生成浓度为4.25g/L。   本研究采用全细胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺,克服了发酵法代谢产物复杂、底物转化率低等缺陷,简化了后续的分离工艺;与酶法相比,酶的稳定性更好,耐有机溶剂的适应性更强,更易实现能量和辅酶的原位再生。
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