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[目 的]心肌缺血再灌注（Ischemia-reperfusion,I/R）损伤的病理生理机制复杂,自噬流受损在I/R损伤中起到重要作用,但其具体的作用及调控机制尚未完全阐明。自噬（autophagy）与泛素蛋白酶体系统（Ubiquitin proteasome system,UPS）作为生物体两个主要降解系统共同作用参与众多疾病的发生发展。其中,E2泛素结合酶（Ub conjugating enzymes,E2）家族在UPS中处于核心地位,UBE2D3作为E2泛素结合酶家族中的重要成员,参与细胞凋亡、DNA损伤反应、肿瘤发生和细胞周期控制等一系列细胞基础活动。本课题通过体内外实验研究,探讨UBE2D3介导的自噬流受损在心肌I/R损伤中的作用机制,为临床防治心肌I/R损伤提供科学依据。[方 法]1.体内动物实验（in vivo）:结扎SD大鼠冠脉左前降支45 min之后剪去结扎线恢复血流灌注2 h建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。在心肌缺血前1 h腹腔注射15μg/kg蛋白酶体抑制剂MG132进行预处理。采用Ⅱ导联监测大鼠心电图（Electrocardiogram,ECG）的变化判断造模是否成功;采用TTC染色检测心肌梗死面积;ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase activity,LDH）检测试剂盒分别检测血清中CK-MB和LDH含量;采用蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）检测UBE2D3、Ub,自噬相关蛋白LC3、p62、beclin1和p-mTOR等蛋白表达水平;同时用免疫荧光检测p62和UBE2D3的蛋白表达水平。2.体外细胞实验（in vitro）:以大鼠H9c2心肌细胞构建体外细胞实验模型。采用无血清、低糖培养基和氧气浓度为5%的方法构建细胞氧糖剥夺模型（oxygen and glucose deprivation model,OGD）,细胞OGD培养2 h之后,换成含10%胎牛血清、高糖培养基、正常氧含量培养4h建立体外I/R损伤（2h/4h）模型。在OGD之前给予20 μm MG132以及氯喹（CQ）5μm预处理1 h。同时采用si-RNA构建UBE2D3和p62敲低的H9c2细胞,以及质粒转染构建的p62过表达H9c2细胞进行实验。用WB检测UBE2D3,Ub,自噬相关蛋白LC3,p62,beclin1和p-mTOR等的蛋白表达水平;质谱分析检测mTOR富集的信号通路;免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,IP）检测UBE2D3与p62之间蛋白互作关系,以及泛素化的p62的表达;免疫荧光IF（Immunofluorescence assay,IF）检测p62、beclin1和UBE2D3的蛋白表达;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平。[结 果]1.心肌I/R损伤中UBE2D3的表达显著上调（p<0.05）,体内外实验证实UBE2D3的表达变化呈时间依赖性。随着再灌注时间的延长,UBE2D3先升高后逐渐下降到基础水平（p<0.05）;2.与NC组H9c2心肌细胞相比,UBE2D3敲低的H9c2细胞中IR损伤导致的细胞凋亡水平明显下降（p<0.05）;3.UBE2D3敲低显著改善I/R损伤诱导的自噬流受损。在未敲低的H9c2细胞中,I/R组p-mTOR表达下降,同时beclin1上调,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62均升高。与加入自噬抑制剂氯喹CQ之后结果相似（p<0.05）。表明在心肌I/R损伤中自噬被激活并且伴随自噬流受损。用si-RNA干扰UBE2D3之后p62上调,同时LC3-Ⅱ表达水平下降（p<0.05）,表明在I/R损伤中敲低UBE2D3之后自噬流恢复通畅;4.UBE2D3通过促进p62泛素化加重I/R损伤诱导的自噬流受损。在I/R损伤中Ub和泛素化的p62均升高,敲低p62之后自噬的标志性蛋白LC3-Ⅱ上调,而p62过表达之后LC3-Ⅱ表达水平下降（p<0.05）,表明I/R损伤中自噬的调节依赖p62。免疫共沉淀的结果证实UBE2D3与p62之间有相互作用的关系,UBE2D3敲低显著降低p62的泛素化水平（p<0.05）,证实在I/R损伤中UBE2D3可以促进p62泛素化。在大鼠I/R损伤模型中,加入蛋白酶体抑制剂MG132可显著上调p62的泛素化水平,大鼠心肌梗死面积也增大,并且血清中CK-MB和LDH的表达水平也上升（p<0.05）。以上结果表明,在I/R损伤中,UBE2D3表达增加可促进p62泛素化从而加重心肌细胞死亡;5.UBE2D3还可以通过负调控p-mTOR参与I/R损伤中自噬的调节,但是涉及的机制不依赖mTOR-beclin1轴。质谱分析结果证实UBE2D3与mTOR有蛋白互作关系,敲低UBE2D3之后p-mTOR上调,同时LC3-Ⅱ表达水平下降（p<0.05）,自噬明显被抑制。然而beclin1呈现上升趋势（p<0.05）,与LC3-Ⅱ的变化不一致。这些结果表明在I/R损伤中,UBE2D3可以参与mTOR对自噬的调节,但是该机制独立于mTOR-beclin1 通路。[结 论]在心肌I/R损伤中UBE2D3可以促进p62泛素化从而加重自噬流受损;此外,UBE2D3可以负调控mTOR,但是该机制不依赖mTOR-beclin1途径。