论文部分内容阅读
背景：肝细胞癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，预后较差，每年约有50万-100万人死于肝癌。手术切除是世界公认的治疗肝癌最好的方式，但是手术后总的5年生存率较低，大肝癌为34.6%，小肝癌为62.9%。近年来，随着科学技术的不断发展，一些新的治疗方法逐渐进入人们的视野。μ-阿片受体（MOR）是阿片受体超家族成员之一，广泛分布于体内。研究发现，MOR激活可促进多种细胞增殖，包括肿瘤细胞（如肺癌，乳腺癌，神经母细胞瘤和结肠癌等）的生长，这意味着MOR在多种细胞的增殖和分化中发挥重要作用。以往实验表明，MOR在肝癌细胞及组织中表达。然而，MOR如何影响肝细胞癌的进展尚不明确。除此之外，MOR促进肿瘤生长的相关机制也鲜少报道。目的：以往实验表明，MOR在肝癌组织及细胞中表达，但MOR影响肝癌进程的机制尚不明确。本实验的目的是研究MOR在肝癌组织及细胞的表达水平并探讨MOR下调对人类肝癌进展的影响及可能的机制。方法：1.选取人肝癌细胞系HepG2、BEL7402及人正常肝脏细胞系LO2为研究对象，利用RT-PCR及Western blot检测各细胞系中MOR mRNA及蛋白质的表达水平。另外，收集2009至2010年间，吉林大学第一医院手术切除的病理证实为肝癌并且未曾治疗过的60例肝癌组织和20例因肝脏创伤、肝内胆管结石等手术而获得的正常肝组织。将上述组织经石蜡包埋切片后，利用免疫组化分析MOR在肝癌组织与正常肝组织中的表达情况。2.对人肝癌HepG2细胞进行不同浓度的MOR siRNA转染后，采用RT-PCR和Western blot检测siRNA的干扰效率；不同浓度的纳洛酮和不同浓度的MORsiRNA分别处理HepG2细胞24、48及72小时后，采用MTT法测定细胞活力，分析MOR下调对HepG2细胞生长的影响；用Hoechst33342染色后，在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况；用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；用PI染色，采用流式细胞仪检测细胞周期的变化；采用RT-PCR和Western blot分别检验JNK mRNA、MKK7mRNA、JNK蛋白和MKK7蛋白表达及其磷酸化水平，研究MOR下调影响人肝癌细胞生长的分子机制；利用RNA干扰来沉默MKK7表达并观察人肝癌细胞的生长，进一步验证MKK7在MOR下调抑制人肝癌细胞生长中是否起到关键作用。3.体内实验中，分别利用HepG2细胞、MOR沉默后的HepG2细胞建立裸鼠肿瘤模型，观察各组的肿瘤生长情况；饲养四周后处死，切除皮下移植瘤组织，采用游标卡尺测量肿瘤体积。结果：1.通过分析RT-PCR及Western blot检测结果，发现在HepG2及BEL7402两种肝癌细胞系中，MOR mRNA及MOR蛋白表达水平均高于正常肝细胞系LO2。另外，通过免疫组化结果，发现人类肝癌组织中MOR表达明显高于正常肝脏组织。2.利用RNA干扰技术可有效沉默MOR基因进而影响MOR表达，45nM的MOR siRNA转染HepG2细胞24小时，可以显著降低MOR mRNA的表达水平，MOR蛋白的表达水平也相应地下降，可持续至少72小时。随着纳洛酮和MORsiRNA浓度的增加，HepG2细胞的活力下降，表明MOR下调能够抑制人肝癌细胞的生长。经纳洛酮及MOR siRNA处理过的HepG2细胞，Hoechst33342染色后发现细胞染色质固缩，亮度明显高于正常对照组；流式细胞仪检测结果示其细胞凋亡率分别为18.36％和22.99％，均高于对照组（6.6％），并且停滞在G0/G1期的细胞数显著增加。通过纳洛酮和MOR siRNA处理HepG2细胞使其MOR表达下调后，发现MKK7mRNA和MKK7的蛋白表达水平没有明显变化，而MKK7磷酸化水平显著增加；此外，我们发现JNK及其磷酸化水平增加。为了进一步验证MKK7在MOR下调抑制肝癌进程中的关键性作用，我们利用RNA干扰技术沉默NKK7基因，发现与单纯MOR下调组相比，MKK7被沉默后，肝癌细胞的A490nm的吸光度值明显增加，这说明MOR下调对细胞增殖的抑制作用减弱。同时，Western blot结果显示MKK7被沉默后JNK及其磷酸化水平下降。3.体内研究发现，正常对照组的5只裸鼠均发生肿瘤，成瘤率达到100％，MOR siRNA组有4只裸鼠发生肿瘤，成瘤率80％。MOR siRNA组与正常对照组相比，肿瘤的生长受到明显抑制。结论：1. MOR在人肝癌细胞和肝组织中的表达水平均高于正常肝细胞和组织。2.阿片受体拮抗剂纳洛酮及siRNA沉默MOR均可引起人肝癌细胞的MOR下调；MOR下调会促进肝癌细胞凋亡、将细胞周期阻滞在G0/G1期; MOR的下调会促进MKK7磷酸化，JNK及其磷酸化水平增加，抑制人肝癌细胞增殖。3. MOR下调后的肝癌细胞降低了裸鼠成瘤率、抑制肿瘤生长、进展，这可能与人肝癌细胞的MOR下调有关，具体的机制有待进一步研究。