论文部分内容阅读
研究背景及目的:纤毛疾病是指由于纤毛功能障碍引起的一类系统性疾病。到目前为止,大约有200多个基因被发现与纤毛疾病有关。在这些基因中,Tectonic(TCTN)基因突变是一些初级纤毛疾病的重要致病原因。TCTN基因家族包括三个成员:TCTN1、TCTN2、TCTN3。这些基因编码的TCTN蛋白主要分布在纤毛的过渡区,参与纤毛的形成和一些信号通路如Sonic Hedgelog(Shh)的调控。该TCTN基因家族的突变会导致许多纤毛类疾病,如Joubert综合征、Bardet-Biedl综合征、Oral-facial-digital综合征、Meckel-Gruber综合征等。以前的研究表明,在人和小鼠中,TCTN1和TCTN2的基因突变会导致神经管发育缺陷以及脑发育异常,但TCTN3基因在大脑发育中的作用却仍不清楚。因此,本课题利用piggy Bac转座子系统产生的Tctn3基因敲除小鼠来探究Tctn3对神经管发育和Shh信号通路的影响,以及探讨调控细胞死亡的机制。实验方法:培育piggy Bac转座子系统产生的Tctn3基因敲除小鼠,以定量PCR(Q-PCR)方法检测孕10.5(E10.5)天的Tctn3基因敲除(knockout,KO)小鼠和杂合敲除(Heterozygote,Het)小鼠脑组织中Tctn1、Tctn2、Tctn3 m RNA表达;观察出生后存活的Tctn3 KO小鼠的外形以及进行骨染色,观察Tctn3 KO对小鼠发育的影响;通过免疫荧光染色观察E10.5 Tctn3 KO小鼠和Tctn3 Het小鼠神经管发育相关蛋白的表达和分布,研究Tctn3 KO对神经管发育的影响;收集E10.5的小鼠脑组织进行RNA测序分析,同时Q-PCR验证E12.5天Tctn3 KO小鼠脑组织Shh信号通路相关基因m RNA表达变化;利用免疫荧光染色检测E12.5的Tctn3 KO小鼠神经元数量的变化,并使用Western blot检测脑组织凋亡标记物Bcl2、Bax、Cleaved PARP1的变化以及Shh信号通路调节的PI3K/Akt信号通路和m TOR信号通路的变化;培养原代胚胎成纤维细胞(p MEFs),通过流式细胞仪检测Tctn3 KO小鼠原代胚胎成纤维细胞的凋亡情况以及给予Akt特异性激动剂SC79对凋亡影响;为探讨Tctn3的调控机制,利用Western blot法检测Nphp1(纤毛过渡区的抗凋亡蛋白)在E12.5小鼠胚胎脑组织表达,并利用免疫共沉淀检测Tctn3和Nphp1之间的相互作用;NIH3T3细胞转染Nphp1质粒,观察Nphp1过表达对Tctn3敲减的细胞凋亡、Shh信号及PI3k/Akt信号的影响。实验结果:我们研究结果表明Tctn3 KO小鼠中没有检测到Tctn3 m RNA的表达,证实该基因在该小鼠中被敲除,而Tctn3基因敲除不影响Tctn1和Tctn2 m RNA表达;统计发现几乎有一半Tctn3 KO小鼠死于E14.5,Tctn3 KO小鼠表现出全身发育异常包括眼球变小、眼睑闭合、多指畸形、胚胎致死;出生后1-2天仍存活的Tctn3KO小鼠骨染色发现Tctn3 KO小鼠头部呈圆顶状且闭合不全、前后长度减少和胸骨异常融合。这些结果提示Tctn3基因敲除造成小鼠发育畸形和胚胎致死。免疫荧光染色表明E10.5 Tctn3 KO小鼠胚胎腹侧神经管Shh和Foxa2表达明显降低,神经管标记物Nkx2.2、Olig2、Hb9、Isl1/2、Pax6的表达区域发生了改变,移向腹侧,而Pax3表达没有改变。特别重要的是纤毛特异性标记物蛋白Arl13b表达明显减少。RNA测序后KEGG富集分析和聚类分析发现Tctn3 KO小鼠中Shh和Shh信号通路相关基因明显下调,如Gli1和Ptch2等。Q-PCR结果进一步证实Shh信号通路下游的Gli1和Ptch1 m RNA表达水平在Tctn3 KO小鼠中显著减少。这些结果提示Tctn3基因敲除影响了Shh信号通路相关基因表达。我们还发现Tctn3KO小鼠脑组织中Neu N阳性细胞显著减少;同时抗凋亡蛋白Bcl2明显表达减少,而剪切的PARP-1和促凋亡蛋白Bax显著增加。流式细胞仪检测培养的Tctn3 KO小鼠原代胚胎成纤维细胞也存在显著的细胞凋亡;Akt的特异性激动剂SC79处理细胞显著减少了凋亡细胞,提示Tctn3基因敲除引起了PI3k/Akt依赖的细胞凋亡。Nphp1存在于纤毛过渡区且有抗凋亡蛋白作用,我们检测发现在E12.5 Tctn3 KO小鼠胚胎脑组织Nphp1含量明显降低,免疫共沉淀结果表明Tctn3和Nphp1可能存在相互作用。Nphp1过表达抑制了Tctn3敲减细胞的凋亡,以及逆转了细胞内Shh信号和PI3k/Akt信号的降低,证实Tctn3可能通过与Nphp1形成复合物起到抗凋亡作用。结论:Tctn3基因敲除抑制了Shh信号通路的激活并造成了小鼠胚胎发育异常和胚胎期致死,特别是影响了神经管发育,造成脑发育异常。Tctn3基因敲除引起了神经细胞凋亡增加;作为与Tctn3共存于纤毛过渡区的蛋白,Nphp1能够与Tctn3形成蛋白复合物参与调控神经细胞的凋亡。探讨Tctn3蛋白功能以及其在纤毛疾病的发病机制,将有助于纤毛病的诊断和治疗,提高患者的生活质量。