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类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是最常见的以全身关节病变为主的慢性自身免疫性疾病,尚无有效的治疗方法。由于类风湿关节炎日益渐增的发病率迫切需要明确其发生机制,为其防治提供有效的靶点。已证实成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)在类风湿关节炎的发生和发展过程中发挥重要作用,寻找抑制FLSs增殖的重要靶点,是治疗类风湿关节炎的关键。研究表明NOD样受体(NLRs)是细胞质中的模式识别受体家族,与炎症性疾病有关,可促进侵袭性病变的快速清除。NLRC5作为NLRs家族中分子量最大的蛋白,其在免疫细胞和免疫相关组织如B细胞和肝脏中表达丰富,参与调节炎症反应和细胞死亡过程。有研究表明NLRC5连同其同家族成员NLRP3在炎症和自身免疫性疾病中起着关键作用,与类风湿关节炎的发生有着十分紧密的联系。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)近年来被认为能够调节多种生物学过程,MEG3(maternally expressed gene 3)是其中新发现的一种。很多研究表明母系表达基因3(MEG3)具有肿瘤抑制功能,肿瘤中MEG3的表达下降与其启动子区高甲基化有关,且研究发现MEG3可调控NLRC5的表达。活化的FLSs可以表现出像肿瘤细胞一样的攻击行为,那么MEG3是否参与类风湿关节炎的形成及FLSs的增殖活化,其作用机制是否与调控NLRC5的表达有关,本课题就此问题进行相关的实验研究。对此本课题组使用完全弗氏佐剂(CFA)诱导的大鼠作为动物模型,研究MEG3调控NLRC5影响类风湿关节炎的发生发展及其作用机制,实验分以下5个部分。1.MEG3和NLRC5在关节炎大鼠组织和细胞中的表达变化收集关节炎大鼠滑膜组织和原代FLSs,利用Western Blot、qRT-PCR、免疫组化和免疫荧光法检测MEG3和NLRC5的表达情况。结果表明,MEG3在关节炎大鼠模型组中的表达显著低于对照组大鼠,而NLRC5的表达显著高于对照组大鼠的表达。同时关节炎大鼠滑膜组织和细胞中炎症因子和FLSs的增殖情况也显著高于对照组。2.过表达MEG3对NLRC5表达和细胞增殖的影响为研究过表达MEG3后NLRC5的表达情况,本实验采用WesternBlots和qRT-PCR法分析NLRC5的表达。结果表明,过表达MEG3后NLRC5的蛋白和mRNA表达与对照组相比显著降低,同时炎症细胞因子TNF-α和IL-6的表达也明显下降。MTT法和细胞周期实验发现,过表达MEG3后FLSs的细胞活力和增殖情况明显下降。以上实验提示,过表达MEG3可抑制NLRC5的表达和FLSs的增殖。3.沉默NLRC5对炎症因子和FLSs增殖的影响为探究沉默NLRC5后炎症因子和FLSs增殖的变化,本课题在原代滑膜细胞中转染NLRC5小干扰RNA。结果发现,沉默NLRC5后炎症因子TNF-α和IL-6的水平同对照组相比显著降低。MTT和细胞周期实验结果表明,沉默NLRC5后FLSs的细胞活力和增殖明显减退。上述实验提示,沉默NLRC5后可降低炎症因子的水平和FLSs的细胞增殖。4.MEG3在关节炎大鼠滑膜组织和细胞中的甲基化程度通过MSP实验检测滑膜组织和细胞中MEG3的甲基化状态。结果表明,关节炎大鼠滑膜组织和FLSs中MEG3基因启动子区明显甲基化,使用甲基化抑制剂5-azadC刺激可以抵消其甲基化状态。此外,使用5-azadC刺激后发现MEG3表达上调,NLRC5表达下调,炎症因子TNF-α和IL-6的水平同对照组相比明显降低。MTT法和细胞周期分析表明,5-azadC刺激后可显著降低模型组大鼠原代FLSs的增殖。5.DNMT1在关节炎大鼠滑膜组织和细胞中的表达变化收集建立的类风湿关节炎大鼠模型的滑膜组织和原代滑膜细胞,利用Western Blot、qRT-PCR和免疫组织化学法分析DNMT1的表达情况。结果表明,DNMT1在滑膜组织和原代细胞中的表达水平明显高于正常对照组,过表达MEG3以及使用5-azadC刺激原代滑膜细胞后DNMT1的水平显著下降。综上,本课题研究发现MEG3可能通过自身基因启动子区甲基化调控NLRC5的表达进而参与类风湿关节炎的发生发展。