背景:随着核技术的广泛应用,急性放射损伤的发生几率不断增加。放射防护、放射病救治以及肿瘤放疗毒副作用的防治等,是目前迫切需要解决的难题。机体短时间内受到大剂量辐射后会引起急性放射病(Acute radiation sickness,ARS),根据照射剂量、病理变化及临床等特点可分为骨髓型、肠型和脑型。辐射剂量1-9 Gy时常引起骨髓型ARS(Hematopoietic acute radiation sickness,h-ARS),而在较高剂量(6-9Gy)暴露后,患者可能出现造血功能衰竭而危及生命。因为骨髓中的造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSCs)对辐射非常敏感,几乎会被放射线全部杀死,因此,目前对于h-ARS的救治,HSCs移植仍然是最常用的手段。然而,已有的研究却表明,这种治疗手段并不能显著增加患者的存活率。HSCs移植可能有效地补充了HSCs数量,但这些细胞却不能在被辐射损伤的造血微环境中有效地发挥造血功能。因此,骨髓造血微环境的结构破坏和功能缺失,可能是HSC移植治疗骨髓辐射损伤失败的主要原因。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是造血微环境的重要组成部分,为HSCs提供必要的物质支持,并分泌多种细胞因子调控HSCs的自我更新、分化和维持。目前认为,BMMSCs具有相对较强的辐射抵抗能力,能抵抗对造血干细胞致死剂量的辐射而部分存活,但其造血支持功能则可能受到辐射损伤而减低,已知的表现有成骨、成脂定向分化能力失衡,成骨分化被抑制致使造血龛结构缺失,导致骨髓造血微环境结构与功能的异常和细胞因子网络紊乱;而成脂分化增强则可能直接抑制造血作用。因此,BMMSCs的相对辐射抗性对于h-ARS的救治有非常重要的意义。BMMSCs辐射耐受的机制可能涉及有效的DNA损伤识别、双链断裂修复、细胞凋亡逃避等,但目前尚未完全阐明。机体辐射损伤时,产生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)攻击细胞大分子尤其是DNA分子,DNA双链断裂是辐射致细胞损伤的重要因素,直接导致了后续的多种病理损伤。核因子E2 p45相关因子2(Nuclear factor E2 p45-related factor 2,NRF2)是一种细胞保护性转录激活因子,在机体应激反应中能转录激活多种细胞保护性基因和抗氧化基因,在防御ROS引起的细胞损伤时起着至关重要的作用。在正常情况下,NRF2在胞质中不断被KEAP1-Cul3泛素连接酶E3复合体泛素化,再被蛋白酶体降解。外部压力诱导NRF2与KEAP1分离,NRF2转位入核,与抗氧化反应元件(Antioxidant-responsive element,ARE)结合,激活下游靶基因的转录表达。氧化应激引起的KEAP1共价修饰和PKC介导的NRF2 Ser40位点的磷酸化均有助于NRF2与KEAP1离解。因此,NRF2/ARE通路对于氧化应激调控作用可能是BMMSCs辐射抗性的重要分子机制。但目前关于NRF2与BMMSCs辐射抗性之间的研究还比较少。CR6结合因子1(CR6-interacting factor 1,CRIF1)是一种多功能蛋白,具有调控细胞周期和增殖的作用,也能与多种转录因子交互作用,并且是线粒体核糖体大亚基的组成蛋白。目前,关于CRIF1对于ROS的调控作用,还存在一些争议,有报道认为,CRIF1能介导NRF2的泛素化,促进ROS的产生,但其他研究者则表示,CRIF1不足可导致多种功能缺陷,包括线粒体功能的恶化,产生高水平的线粒体ROS。因此,为深入了解CRIF1对于NRF2的具体调控关系,以及二者在BMMSCs辐射后氧化应激调控中的分子机制,本研究应用体外分离培养人BMMSCs的辐射损伤模型以及Nrf2-/-敲基因小鼠模型,对CRIF1调控BMMSCs辐射后氧化应激的重要作用进行了研究,并进一步探讨了CRIF1调控NRF2信号通路的的分子机制。材料与方法:1.通过密度梯度离心法分离并培养原代人骨髓BMMSCs,并对培养细胞进行间充质干细胞特征鉴定;骨髓样本来自健康的知情同意捐赠者;2.由于9 Gy剂量辐射通常是出现h-ARS的剂量上限,故本研究采用9Gy Co-60对BMMSCs进行辐射,辐射剂量率为700 c Gy/min;而小鼠的辐射耐受小于人体,根据文献报道,Nrf2-/-基因敲除小鼠采用5 Gy Co-60的全身照射(total body irradiation,TBI),辐射剂量率同上;3.Crif1 sh RNA(或对照空病毒载体)慢病毒载体转染BMMSCs,降低BMMSCs中的CRIF1的蛋白表达水平;4.免疫印迹法(Western blot)检测BMMSCs辐射前后目标蛋白的表达水平变化情况;5.提取细胞总RNA后合成c DNA,应用实时荧光定量PCR法检测BMMSCs中目标基因的m RNA相对表达水平;6.应用细胞免疫化学法和激光共聚焦显微镜观测BMMSCs辐射前后CRIF1和NRF2的亚细胞定位变化情况;7.应用免疫共沉淀实验检测BMMSCs中的CRIF1和PKC-δ两种蛋白之间是否有相互作用;8.Annexin-V/PI染色后流式细胞仪检测分析BMMSCs辐射前后的细胞凋亡情况;9.SA-β-gal染色检测BMMSCs辐射前后的细胞衰老情况;10.使用DCFH-DA或DHE荧光探针检测BMMSCs辐射前后胞内ROS水平的变化;11.应用谷胱甘肽含量测定试剂盒来检测BMMSCs辐射前后的谷胱甘肽含量变化;12.流式细胞仪检测Nrf2-/-小鼠辐射前后四色荧光抗体标记的BMMSCs计数变化和ROS水平变化;应用间接荧光抗体流式检测法分析这些细胞中CRIF1蛋白表达水平的变化。结果:1.BMMSCs辐射后氧化应激程度增加,并诱导后续的细胞衰老。1.1 BMMSCs在9 Gy辐射后,胞内ROS水平立即增加,在4h达到峰值,24 h时有一定程度的恢复,但仍高于静息水平;同时,BMMSCs中的谷胱甘肽(GSH)含量在辐射后也显著升高,表明BMMSCs在辐射后早期阶段的氧化应激显著增加;1.2 9 Gy辐射后,BMMSCs凋亡细胞比例仅从8.29%上升到9.45%,表明BMMSCs具有相对较强的抗放射性;1.3 SA-β-gal染色显示9 Gy辐射后72 h,BMMSCs细胞衰老程度显著增加;细胞衰老相关蛋白RB、p53和p21在辐射后48 h和72 h使均显著增加(但p16没有显著改变)。这些结果表明,9 Gy辐射可能诱导BMMSCs的细胞衰老;2.慢病毒干扰载体降低CRIF1的表达,将加剧BMMSCs辐射后的氧化应激程度2.1干扰CRIF1细胞辐射后,胞内ROS水平几乎在所有时间点均高于对照组,特别是在4 h时,而且24 h后仍显著高于静息态水平;干扰组细胞的GSH含量在辐射后较对照组细胞升高更加显著;2.2干扰CRIF1细胞在辐射后48 h时,细胞凋亡率较对照细胞显著增加;2.3在辐射后72 h时,干扰组细胞的细胞衰老程度较对照细胞显著增加,而且,干扰组细胞的衰老相关蛋白RB、p53和p21表达较对照组显著增加,但p16无显著变化。3.辐射改变NRF2和CRIF1蛋白的亚细胞定位,诱导二者转位入核并共定位,并使其蛋白水平升高3.1在辐射后早期,NRF2蛋白水平显著增加,在4-8 h时最高,随后开始下降,至12 h时恢复到静息态甚至更低的水平;而CRIF1蛋白水平在辐射早期升高后,并没有出现明显的减少,到24 h时仍高于静息态水平;3.2 NRF2下游目标基因Gclc和Ggt1的m RNA和蛋白表达水平,在辐射后BMMSCs中均呈现出与NRF2相似的趋势,即辐射后早期升高;3.3由于NRF2转位入核是其转录激活下游靶基因的关键步骤,因此,我们检测了BMMSCs辐射后4 h时NRF2的转位入核情况。首先,分别提取细胞浆蛋白和核蛋白,WB实验检测辐射前后NRF2在胞浆和胞核中的蛋白变化;再应用细胞免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察NRF2和CRIF1的亚细胞定位情况。二者结果均显示,NRF2和CRIF1在BMMSCs辐射后4 h时转位入核均显著增加。另外我们还发现,NRF2和CRIF1转位入核后,在核内出现共定位的现象。这些数据提示,CRIF1可能参与了细胞辐射后NRF2的核转位调控。4.干扰CRIF1表达,BMMSCs辐射后NRF2蛋白升高程度和核转位均受到抑制4.1干扰CRIF1表达后,BMMSCs中的NRF2蛋白含量显著降低,而NRF2的相对m RNA表达却没有明显改变,这表明干扰CRIF1表达仅在蛋白水平影响了NRF2的含量;4.2对细胞进行辐射后,干扰组细胞的NRF2蛋白水平在辐射后各个时间点几乎都低于对照组细胞,而且,我们还观察到,干扰组细胞的NRF2蛋白水平在辐射后到达峰值的时间(4 h)早于对照组细胞(8 h),但峰值的蛋白水平却低于对照细胞。这些结果提示,干扰CRIF1可能降低了NRF2的蛋白稳定性,降低了其在辐射后的升高程度;4.3我们检测了干扰CRIF1后NRF2在辐射后的入核情况。WB实验检测辐射后8 h时胞浆和胞核中NRF2的蛋白量变化,细胞免疫荧光实验观察辐射后8 h时NRF2和CRIF1在BMMSCs中的亚细胞定位变化情况。结果显示,干扰组细胞在辐射后8 h时,NRF2的核内蛋白水平和入核聚集程度均显著低于对照组细胞;4.4我们随后检测了NRF2下游靶基因Ho1,Ggt1和Gclc的m RNA表达水平和蛋白表达水平,其结果与NRF2的变化趋势基本一致,即干扰CRIF1组细胞的Ho1,Ggt1和Gclc m RNA相对表达水平和蛋白表达水平,在辐射后的各个时间点均低于对照组。因此,我们推断,CRIF1可能通过影响辐射后NRF2的转位入核,来调控BMMSCs辐射的氧化应激;4.5我们应用Nrf2-/-敲基因小鼠的5Gy TBI模型,在体内验证CRIF1和NRF2之间的调控关系。首先,Nrf2-/-敲基因小鼠辐射后BMMSCs的数量较野生型有所减少,而ROS水平较野生型升得更高,这表明NRF2对辐射后的BMMSCs具有重要的保护作用,失去NRF2的抗氧化作用,辐射产生的高水平ROS将加速细胞的死亡;其次,通过间接荧光法我们发现,无论NRF2敲除与否,小鼠辐射后其BMMSCs中CRIF1蛋白水平均出现相似程度的增加,这就表明,NRF2并非CRIF1的蛋白调控因子,而是CRIF1调控NRF2的蛋白水平。5.CRIF1共激活PKC-δ磷酸化NRF2 Ser405.1 PKC-δ磷酸化NRF2 Ser40是NRF2与KEAP1解离并转位入核的关键调控机制。因为之前的结果表明,CRIF1可能影响NRF2辐射后的核转位,因此,我们推测CRIF1可能影响了NRF2 Ser40的磷酸化水平而导致后者的亚细胞定位改变。为证实这一假说,我们首先检测了BMMSCs中NRF2 Ser40的磷酸化水平。结果显示,在静息条件下,干扰CRIF1的BMMSCs中NRF2 Ser40磷酸化水平显著降低。随后我们又检测了辐射后NRF2 Ser40磷酸化的变化,结果表明,干扰组细胞的NRF2 Ser40磷酸化水平在辐射后的各个时间点均显著低于对照组;5.2之前的结果提示,CRIF1可能影响了NRF2 Ser40的磷酸化水平,因此,我们进一步推测,CRIF1可能影响了PKC-δ的磷酸酶活性。首先我们检测了CRIF1与PKC-δ的交互作用,Co-IP实验结果显示,二者之间可能存在胞内交互作用。这就提示我们,CRIF1可能通过与PKC-δ直接作用来影响后者的磷酸化活性;5.3为证实CRIF1对于PKC-δ磷酸化活性影响,我们使用了三种不同效能的PKC激活剂来处理BMMSCs。结果显示,在这三种PKC激动剂的作用下,CRIF1干扰细胞的NRF2 Ser40磷酸化水平的升高程度均显著低于对照组细胞。我们还检测了NRF2的下游蛋白HO1的表达,结果与之一致,即PKC激动剂处理细胞后,CRIF1干扰细胞的HO1升高程度均显著低于对照组细胞。这就表明,CRIF1是PKC-δ磷酸化NRF2 Ser40的共激活因子,促进NRF2核转位后转录激活下游蛋白表达。结论:1.BMMSCs在9 Gy辐射后,氧化应激增加,胞内ROS水平和GSH含量显著升高;细胞衰老显著增加,但细胞凋亡,细胞凋亡变化不明显;辐射后72 h,衰老相关蛋白RB、p53和p21表达上升,但p16的变化不明显;2.干扰CRIF1表达,BMMSCs在9 Gy辐射后,氧化应激较对照组增加;细胞凋亡和细胞衰老均较对照组增加;辐射后72 h,衰老相关蛋白RB、p53和p21表达较对照组增加,但p16较对照组变化依然不明显;3.CRIF1在蛋白水平影响NRF2的亚细胞定位,是NRF2辐射后入核的辅助因子;4.CRIF1共激活PKC-δ磷酸化NRF2 Ser40,调控NRF2的核转位。总之,CRIF1共激活PKC-δ磷酸化NRF2 Ser40,增加NRF2稳定性并转位入核,转录激活下游抗氧化因子,缓解BMMSCs辐射后氧化应激对细胞的损伤。