论文部分内容阅读
肺癌细胞的多药耐药（MDR）是药物治疗失败的重要原因，突破多药耐药障碍，提高药物治疗肺癌的效果，是肺癌基础和临床研究的重点。 目前与肺癌多药耐药有关的机制主要有以下几个方面：1．发生在细胞膜水平的药物摄取减少和外排增多，引起细胞内药物的绝对浓度降低，如由P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）引起得耐药。2．发生在细胞质和细胞器水平的药物亚细胞分布的改变，使药物无法接近起作用靶点，引起药物有效浓度降低，如由多药耐药相关蛋白（MRP）引起的耐药。3．肺耐药相关蛋白（LRP）对化疗药物的胞吐作用。4．乳腺癌耐药蛋白（BCRP）介导的耐药。但是，有研究表明一些肺癌耐药表型并不表达P-gp、MRP、和LRP，经典的多药耐药路径难以圆满解释这种现象，提示肺癌耐药性的形成可能另外的机制，因此我们认为，随着分子生物学和相关学科的飞速发展，基因克隆策略和技术的不断更新，利用有效的基因克隆技术，发现新的肺癌多药耐药相关基因已成为可能。 本研究采用大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方式，以顺铂为诱导药物，人肺腺癌细胞系SPC-A-1为诱导对象，经过192d的诱导，建立了人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A-1/CDDP。MTT结果表明该细胞系对顺铂、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、长春新碱、和足叶乙甙等药物有不同程度的耐药性。生长曲线、倍增时间、形态学和常规染色体检测显示SPC-A-1/CDDP细胞性状稳定，是可靠的人肺腺癌多药耐药细胞系，可应用于下游实验，同时提示大剂量冲击和逐步增加剂量相结合可缩短药物诱导时间。 在成功诱导建立肺腺癌多药耐药细胞系的基础上，应用抑制消减杂交（SSH），以肺腺癌多药耐药细胞SPC-1-A/CDDP cDNA为实验方（Tester），以肺腺癌细胞 SPC刁 CDNA为对照方①），结合 T／A克隆技术构建了肺腺癌多药耐药细胞差异表达消减 CDNA文库，经斑点杂交筛选获得 21个SPC－A4／CDDP细胞差异表达CDNA片段。测序和同源性分析表明16个CDNA片段与已知基因有93％叫％的同源性，2个CDNA片段为新序列（分别为 337hP 牙 494hP），在 GenBank中末发现同源性，可能代表了某个新基因序列，Northern杂交验证结果表明。DNA片段在SPC－AJ／CDDP细胞上高表达，为肺腺癌多药耐药细胞差异表达cDNA片段。我们的研究表明SSH技术是筛选新基因的有效方法，2个新的CDNA片段是寻找肺腺癌多药耐药相关基因的良好候选者，对其功能的进一步研究，有利于从另外一个角度了解肺癌多药耐药形成的机制。