原发性肝癌是常见的恶性肿瘤,手术切除仍是最有效的治疗方法,但根治术后5年转移复发率高达60-70%,是影响肝癌远期疗效的主要原因。抑制肿瘤血管生成,可减少肿瘤赖以生存的营养供应,从而抑制肿瘤生长。对不能切除的肝癌和肝癌术后转移复发的预防,抗血管生成是一条有希望的途径,但由于缺乏肝癌血管特异的靶点,因而疗效有限。血管异质性是近年肿瘤血管生成研究的热点,从分子水平研究肿瘤血管的异质性,有助于监测肿瘤的演进,估计肿瘤的恶性程度,并可能为肿瘤治疗提供新靶点。迄今,已有结肠癌、肺癌及肾癌等肿瘤血管内皮细胞分子水平异质性研究的报道,尚未见肝癌相关的研究报道。本课题拟通过分离不同转移潜能裸鼠人肝癌的血管内皮细胞,检测其血管生成相关基因表达的改变,以期发现肝癌转移复发过程中,与血管生成密切相关的某些基因表达改变,为肝癌转移复发研究提供新的分子标记和治疗靶点,并进一步研究我们已证实的干扰素抑制肝癌转移复发与血管内皮的关系。 1.肿瘤血管内皮研究的平台建设一裸鼠人肝癌血管内皮细胞的分离与鉴定 血管内皮细胞的数量极为有限,其分离与纯化受多种因素影响,如何从肿瘤组织的多种混杂细胞中分离纯化内皮细胞成为问题的关键。我们采用CD31抗体交联免疫磁珠分选法,并加以优化,对裸小鼠原位人肝癌移植瘤进行血管内皮细胞分选;从肝癌组织中分离的细胞呈现典型的内皮细胞形态特征,免疫组化证实内皮细胞标记分子CD31及VE-Cadherin表达阳性,超过95%的阳性分选细胞呈乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)摄取实验阳性,RT-PCR示获得的细胞中内皮细胞标记分子CD31、VE-Cadherin及CD146的mRNA含量明显高于分离前,而肝癌细胞标记分子AFP及白细胞标记分子CD45在所分选的细胞中呈阴性表达。上述结果表明,采用优化的免疫磁分选法有效地分离纯化了肝癌组织中的血管内皮细胞,分离的内皮细胞可用于肝癌血管生成的相关研究。 2.不同转移潜能人肝癌相关血管内皮基因表达差异的研究 我所前期已建成具有不同转移潜能的人肝癌模型体系。我们对不同转移潜能肝癌来源的血管内皮细胞进行了基因表达分析。采用血管生成相关基因分类芯片分析时发现,不同转移潜能肝癌来源的血管内皮细胞存在差异基因表达。在96个候选基因中,有7个基因的表达与转移潜能变化一致,2个呈负相关(Adamts8,Serpinb5),5个呈正相关(Ctgf,Ets1,PDGFRα,TGFβ3,TIMP-2)。其中,PDGFRα